一對引物之間不應多於4個連續堿基有互補性，以免產生引物二聚體。引物與非特異靶區之間的同源性不要超過70%或有連續8個互補堿基同源，否則會導致非特異性擴增。引物3′端是引發延伸的點，因此不應錯配。由於ATCG 引起錯配有一定規律，以引物3′端A影響最大，因此，盡量避免在引物3′端第一位堿基是A。引物3′末端也不應是編碼密碼子的第三個堿基，以免因為密碼子第3位簡並性而影響擴增特異。引物5′端可以修飾，包括加酶切位點，用生物素、熒光物質、地高辛等標記，引入突變位點、啟動子序列、蛋白質結合DNA序列等。
引物濃度一般要求在0.1～0.5pmol 之間，濃度太高，容易生成引物二聚體，或非特異性產物。
引物變性溫度（Tm)最好在55～70℃範圍。
簡並引物實際上是一類由多種寡核苷酸組成的混合物，彼此之間僅有一個或數個核苷酸的差異。若PCR擴增引物的核苷酸組成順序是根據氨基酸順序推測而來的，就需合成簡並引物。簡並引物同樣也可以用來檢測一個已知的基因家族中的新成員，或用來檢測種間的同源基因。
使用簡並引物的PCR反應，其最適條件往往是憑經驗確定的，尤其是要注意所選定的變性溫度，以避免引物與模板之間發生錯配。有的學者建議，使用熱起始法（hotstart method）能夠有效地克服錯配現象。熱起始法要求將反應混合物先加熱到72℃，然後才加入Taq DNA聚合酶。經過這樣的處理，增加了PCR擴增產物的特異性，所得到的靶DNA片段在EB 瓊脂糖凝膠電泳中可以容易地觀察到，而且背景中的非靶序列的條帶全消失了。
為了盡可能減少非靶序列的擴增，最近已經發展出一種嵌套引物（nested primers）的策略。其具體的操作程序是，利用第一輪PCR擴增產物作為第二輪PCR擴增的起始材料，同時除使用第一輪的一對特異引物之外，另加一至兩個與模板DNA結合位點是處在頭兩個引物之間的新引物。在第二輪擴增產物中，能夠與這一組多引物雜交的錯誤擴增的可能性是極低的，所以應用嵌套引物技術能夠使靶DNA序列得到有效的選擇性擴增。
3.脫氧核苷三磷酸（dNTP）
dNTP 為PCR反應的合成原料。每種核苷酸濃度應相同，dNTP 是dATP，dCTP，dGTP，dTTP 的總稱。反應體係中各種核苷酸的濃度必須一致，即使在被擴增片段的堿基組成比較特別時也應如此。四種核苷酸間濃度的不平衡會增加反應時DNA聚合酶錯配的概率。dNTP 的濃度一般為20～200μmol/L，濃度過高雖能加快反應速度，但非特異性擴增也隨之增加，DNA聚合酶複製DNA時也越容易出錯。降低dNTP 的濃度可相應提高反應特異性。dNTP 儲存液必須為pH7.0左右，其濃度一般為2mmol/L，分裝後置－20℃環境下保存。
4.耐熱DNA聚合酶
耐熱DNA聚合酶是PCR技術實現自動化的關鍵。由於此酶在靶DNA變性的高溫下仍保持活性，所以在PCR擴增DNA的全過程中，隻需一次性加入反應體係，不必在每次高溫變性後再另添加酶。同時它催化聚合反應的最適溫度為70～80℃，此時引物與模板結合的特異性好，故產物的純度高。現在已發現多種耐熱DNA聚合酶，均具有在高溫下仍保持一定酶活性的通性，但不同耐熱DNA聚合酶的性能也存在一定的差別。常見的耐熱DNA聚合酶有TaqDNA聚合酶、PwoDNA聚合酶、TthDNA聚合酶、Vent DNA聚合酶、PfuDNA聚合酶等，但在PCR反應中應用最多的是TaqDNA聚合酶。