（3）延伸（elongation）是將反應體係的溫度升至72℃並維持一定時間，使反應體係中已結合到模板DNA鏈上的引物在聚合酶的作用下，以引物為固定起點，以四種單核苷酸（dNTP）作為底物，按照模板鏈的序列以互補的方式依次把dNTP 加至引物的3′端，合成新的DNA鏈。
上述三個步驟作為PCR的一個循環，由於每個循環所產生的DNA片段作為下一個循環的模板，所以每循環一次，底物DNA的拷貝數增加一倍。因此，反應產物量以指數形式增長，一個分子的模板經過n 個循環可得到2n 拷貝產物，如經過25次循環後，則可產生225個拷貝數的特異性DNA片斷，即3.4×107倍待擴增的DNA片斷。但是，由於每次PCR的效率並非100%，並且擴增產物中還有部分PCR的中間產物，所以25次循環後的實際擴增倍數為1×106～3×106。另外從圖中可以看出，PCR反應經過3個循環，擴增產物中就出現待擴增的特異性DNA片斷。
5.1.2參與PCR反應的成分及其作用
參與PCR反應的成分主要包括：模板核酸、一對寡核苷酸引物、催化依賴模板的DNA合成的耐熱DNA聚合酶、緩衝液、Mg2＋、4種三磷酸脫氧核苷酸（dNTP）、反應溫度與循環次數、PCR促進劑等。現對它們的作用介紹如下：
1.模板
用於PCR的模板核酸可以是DNA，也可以是RNA。核酸模板來源廣泛，可以從動植物細胞、培養的細胞、細菌、病毒、組織、病理樣品、考古樣品等中提取。當用RNA作模板時，首先要進行反轉錄生成cDNA，然後再進行正常的PCR循環，包括基因組DNA、RNA、質粒DNA和線粒體DNA等。模板DNA都需要通過純化以除去DNA聚合酶抑製劑（如SDS、氯仿、乙醇等）和其他雜質（如RNA），以保證有較高的純度。DNA模板中過多的RNA汙染會造成RNA與DNA的雜交或RNA與引物的雜交，導致特異性擴增效率的下降。在用RNA作為擴增模板時，須先將RNA逆轉錄為cDNA，再以cDNA作為PCR反應的模板進行擴增反應。除了上述的DNA或RNA可用作模板外，PCR還可以直接以細胞為模板。
一般來說PCR對模板純度的要求不是很高，模板不需要達到超純。對於來源於組織細胞的模板DNA，隻要先溶細胞，經蛋白酶消化去除蛋白質，再用酚、氯仿抽提，經乙醇沉澱的模板即可應用。某些擴增實驗中甚至可以直接將溶細胞液煮沸加熱，用蛋白質變性後的DNA溶液作模板。但在DNA溶液中，不能有影響擴增反應的物質存在，例如蛋白酶、核酸酶、結合DNA的蛋白質等；另一類是尿素、十二烷基磺酸鈉、卟啉類物質等；還有一類是二價金屬離子的絡合劑（如EDTA）等，會與Mg2＋絡合，影響TaqDNA聚合酶的活性。上述物質的存在會影響擴增效果，甚至使擴增失敗。
一般對於單拷貝的哺乳動物基因組模板來說，100μL 的反應體係中有100ng 的模板已足夠。有時加的模板太多，會令擴增失敗。這時如果對模板稀釋後再加入反應體係中，往往能獲得成功。
2.引物
引物是與靶DNA的3′端和5′端特異性結合的寡核苷酸，是決定PCR擴增產物的特異性和長度的關鍵。隻有當每條引物都能特異地與模板DNA中的靶序列複性形成穩定的結構，才能保證其特異性。一般情況下，設計的引物長度介於15～30個核苷酸之間，3′端必須帶有遊離的-OH基團，反應體係中各引物濃度一般介於0.1～0.5μmol/L之間，過高或過低均不利於反應的正常進行。
引物設計是決定PCR反應成敗的關鍵。引物具有定位和定向作用：一對引物分別與一條單鏈模板結合，並且與靶序列3′端側翼堿基互補，從而限定了引物隻能結合在所識別的鏈上的靶序列3′端。另外由於DAN 聚合酶的5′→3′合成特點，引物的3′端得以延伸，兩引物延伸方向相對並指向靶序列的中央。引物之間的距離決定了擴增靶序列的大小及特定範圍。
PCR反應中，對引物也有一些特殊的要求，引物過短會影響PCR的特異性，要求有16～30bp。引物過長使延伸溫度超過Taq DNA聚合酶的最適溫度，亦會影響產物的特異性。G ＋C 的含量一般為40%～60%。引物的四種堿基應隨機分布，不要有連續3個以上的相同嘌呤或嘧啶存在。尤其是引物3′端不應有連續3個G 或C，否則會使引物與核酸的G 或C 富集區錯誤互補，從而影響PCR的特異性。引物自身不應存在互補序列，否則會引起自身折疊，起碼引物自身連續互補堿基不能大於3bp。兩引物之間不應互補，尤其是它們的3′端不應互補。