亞曆山大對部下作完動員，隨即率領全軍從原路返回，到比拉魯斯河南岸紮營，與大流士隔河相望。兩軍對峙，大戰在即。比拉魯斯河距伊蘇斯城僅八九英裏，故這場即將開始的戰役被稱為伊蘇斯會戰。
波斯方麵在軍隊的人數上要比馬其頓多得多，但沒有一個確切的數字。有人說總數有60萬之多，其中希臘雇傭兵3萬，民兵6萬。有人說總數是50萬，其中騎兵10萬。這顯然誇大了波斯的力量。伊蘇斯平原根本容納不下這麼多的隊伍，波斯帝國也不可能組建如此大的一支軍隊。還有人說波斯軍隊有騎兵和希臘雇傭兵各3萬。這一說也是誇大了的。但不管如何，波斯軍隊比馬其頓的多得多是無可懷疑的。否則就不會那麼狂妄。亞曆山大參加伊蘇斯一役的兵力，隻有步兵兩萬餘人，騎兵5000人。
大流士三世也不完全是個無能之輩，不是個“紙老虎”，他即位之後，曾出兵鎮壓了小亞細亞各城邦的起義，並把埃及重新奪回到自己手中。他的部下對他也一直是忠誠的。現在他禦駕親征，威勢嚇人。
波斯國庫充裕，軍隊裝備精良，士兵配備了盔甲、護脛、長矛、刀劍和盾牌，連戰馬都有鎧甲和披胸。大流士的將士是善戰的，他們決心為他們的國王死戰，應當說，這是一支令人畏懼的軍隊。
大流士列陣以待，他自居全軍中央，這是波斯人的傳統。希臘雇傭軍約15000人被調到陣前，雇傭兵的兩側是由弓箭手掩護的民兵；右翼海岸附近是騎兵。第一線的後麵是亞洲各部族的地方兵力。在沿河岸地帶築起了一道柵欄來加強防衛。
亞曆山大仍把方陣放在中央，兩翼是輕裝步兵和騎兵，左翼由帕米尼歐和他的兒子菲洛塔斯指揮，受命要不顧一切守住海岸；右翼由亞曆山大親自指揮，他要集中兵力從他這一翼突破敵人的防線。
亞曆山大布置調度好了後，先是逐一視察各個營地，用感人的話語鼓舞士兵的鬥誌，然後率領部隊緩緩前進，到進入波斯弓箭手的射程之內時，亞曆山大立即率領右翼部隊以迅雷不及掩耳之勢撲向波斯軍左翼，以雷霆萬鈞之攻勢一舉將其擊潰，接著他轉向波斯軍的中央，與大流士的禦林軍展開激戰。亞曆山大在激戰中表現神勇，既是指揮官，又身先士卒；而大流士則在他的部下的護衛下，趾高氣揚地站在他的戰車上，他的敵人凶狠地攻擊他，他的部下奮身保護他。亞曆山大一見大流士，便向他衝去，要把他陣斬馬下。大流士的兄弟奧克撒拉斯立即聚攏所率騎兵橫攔在大流士戰車前麵。奧克撒拉斯身高體大，身著盔甲，奮力死戰，把衝上來的人一個個打翻在馬下。
“但馬其頓人簇擁著亞曆山大高聲呐喊、互相激勵，突然出現在陣前。接著是一片令人目不忍睹的情景。隻見大流士戰車四周僵臥著一些最高級將領，他們死的光榮，全部臉貼著地，就是在格鬥中倒下去的原樣，傷口都在前身。在這些死者當中可以找到傑出的地方總督和著名的將軍。這些死者周圍積屍累累，都是些藉藉無名的步兵和騎兵之輩。馬其頓人傷亡也很慘重，陣亡者死得十分悲壯。亞曆山大本人右股中劍。這時，大流士戰車上的幾匹挽馬被矛刺傷，痛得發起狂來，甩掉了頸上的軛，險些使大流士摔下車來。大流士害怕落入敵手當俘虜”（C
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羅賓遜著《亞曆山大大帝》），便驅車拚命逃命，完全棄他的部下於不顧，進入山穀後，棄車跳上一匹戰馬奔逃，盾牌、大鬥篷甚至弓箭都扔掉了。不可一世的大流士危急關頭盡顯懦夫的真麵目。
實際上，大流士開始逃跑時，波斯方麵並沒有完全失敗，希臘雇傭軍仍在拚命堅持，帕米尼歐的左翼在波斯軍的壓迫下後退，但大流士逃跑的消息一傳開，波斯軍便全軍潰散，人人爭相逃命。大流士的逃跑使波斯人失去了一切獲勝的可能。戰鬥變成了馬其頓人追殺逃跑的波斯人，夜幕降臨，馬其頓人才停止了追殺。戰鬥結束，戰場上屍骸遍地，其中絕大部分是波斯人的。
在這次戰役中，波斯大軍傷亡慘重，據托勒密說：追趕大流士的馬其頓部隊路上經過一條溝壑，溝壑被波斯軍人的屍體填滿了。有人說，波斯方麵有10萬人戰死，其中包括10000名騎兵，這當然是誇大了的、不確切的數字。和波斯參戰的人數一樣，傷亡的人數，也沒有一個確切的數字。但戰場上留下了上千具波斯人的屍體是毫無疑問的。根據記載，亞曆山大的軍隊死亡了450人，負傷4500人，這個數字可能是真實的。
據普魯塔克的敘述，亞曆山大返回伊蘇斯後，他的部下把他引到大流士的大帳裏。帳內擺滿各種珍寶，琳琅滿目，美不勝收。亞曆山大一走進大帳，立即被華麗的陳設所吸引，驚歎不已。隨後，他脫去鎧甲，走向浴室，並邊走邊說：“讓咱們到大流士的浴室去洗掉戰鬥中的汗水吧！”他的一位朋友說：“不對，應該說是你亞曆山大的浴室，因為被征服者的財產是屬於征服者的。”走進浴室，又為浴室的奢侈和華麗而驚歎。浴室的水管、大水罐和首飾盒都是造型優美的金製品，浴室裏彌漫著香料和膏脂的氤氳香味。
浴後眾人把他帶到大流士的專用的宴會廳，桌上已擺好豐盛的菜肴和精美的各種餐具，亞曆山大轉身對朋友說：“看來這才像個國王的樣子啊！”他如此感歎是觸景生情，他在馬其頓的樸素生活和波斯國王的奢侈豪華生活真有天壤之別！
亞曆山大正要進餐，士兵報告說，被俘的大流士的母親、妻子（同時也是他的妹妹，波斯還有埃及，王室兄妹或姐弟結婚是平常事，甚至是理所當然的，目的是為了保持王室血統的純潔。）和兩個未婚女兒看到了被繳獲的大流士的戰車、鬥篷和弓箭，以為大流士已死，啼哭不止。原來大流士逃跑時，不僅棄軍隊和輜重不顧，他的幾乎所有的家屬也都被他拋棄了，成了亞曆山大的俘虜。據說，亞曆山大聽了士兵的報告後，派人去給她們傳話，告訴她們大流士還活著，大流士逃跑時把武器和鬥篷留在戰車裏了。還告訴她們，亞曆山大允許她們保留皇家的地位和一切皇家特有的東西。因為他和大流士打仗不是出於個人恩怨，而是依法為亞洲的主權而戰。
亞曆山大如此禮待大流士的家眷，目的顯然是為了減輕波斯人的敵對情緒，數年之後，他為使自己的統治地位合法化，甚至和大流士的一個女兒結了婚。大流士的這個女兒是他的第二個妻子，在娶她之前，也是出於政治目的，他娶了一位有權勢的伊朗貴族之女羅克珊娜。亞曆山大不是個好色之徒，他對大流士的妻子就從來沒有非分之想，盡管馬其頓人把她看作是亞洲最美麗的女人。亞曆山大也從未有過情婦，這可能是因為他日理萬機根本無暇接近女色。普魯塔克說他雖生性急躁，常常暴跳如雷，卻並不沉溺於肉欲之歡，在這方麵，他是極有節製的。
勝利的第二天，亞曆山大不顧自己的腿傷，親自探視和慰問了負傷將士，向那些勇敢作戰突出的人發了獎品，組織掩埋了雙方的死亡將士的屍體，為自己一方的死者舉行了隆重的祭禮，設祭台向諸神感恩。
拒絕和談
伊蘇斯會戰的勝利改變了亞曆山大的財政狀況。會戰結束後，亞曆山大派帕米尼歐到大馬士革奪取了大流士的金庫。從這次戰役中他獲得了2600枚金塔倫特和2500公斤的白銀。
伊蘇斯會戰的勝利改善和加強了亞曆山大的政治和軍事地位。這一勝利使整個希臘世界受到極大的震撼，斯巴達王與波斯艦隊合謀解放希臘的計劃流產了，亞曆山大擺脫了兩麵受攻的處境，波斯人對東地中海的控製結束了。亞曆山大對所征服地區的統治也因此得到鞏固。
亞曆山大從越過赫勒斯滂海峽以來，隻用了一年半的時間，兩次對陣戰大敗不可一世的波斯軍隊，驅逐了沿海城市的波斯駐軍，收服了無數的山區部落，征服了一塊其麵積略小於現在的土耳其的地區，他在其占領區內，恢複了大多數城邦的民主政體，並開始建立起一套行政管理機構。他把波斯人統治時總督獨攬大權的製度改成由不同的人分管軍、政、財，總督既有馬其頓人，也有亞洲人。為了促進經濟繁榮，他也開始從事大公共建築的重建工作，例如，他下令重建了以弗所的阿爾特彌斯神廟，這座廟是在他出生的那晚上燒毀的。