3月1日，杜鬆軍抵達薩爾滸（今遼寧撫順東大夥房水庫附近）。杜鬆分兵為二：一部在薩爾滸駐紮，自己親率另一部前往吉林崖，攻打界凡城。由於杜鬆軍輕敵冒進，先於其他各路軍與後金兵遭遇。努爾哈赤決定先集中兵力與杜鬆軍決戰，並故意避其鋒芒，親率大軍猛攻明軍薩爾滸大營。炮聲隆隆，殺聲震天，不久，後金兵便攻下了薩爾滸大營。攻下薩爾滸大營後，努爾哈赤率軍馳援吉林崖。其時，杜鬆軍與駐守吉林崖的後金兵激戰正酣，後金兵正節節敗退，援軍的到來立即使戰場局勢發生逆轉，杜鬆軍腹背受敵，陷入重圍，士氣低落，而後金兵則軍心大振，杜鬆身中十八箭力戰而死，總兵王宣和趙夢麟全部戰死，西路明軍全軍覆沒。
這時北路馬林軍已進至薩爾滸東北的尚間岸，遇到杜鬆軍的敗兵，得知西路軍已覆滅，馬林頓時不寒而栗，士卒也個個喪膽，急忙轉攻為守。
當夜宿營，馬林命在營壘外掘了三層塹壕，外邊又擺了火炮，一副固守的樣子。第二天，努爾哈赤率大軍趕到，立即向明軍發起進攻。明軍幾乎不堪一擊，大部潰逃，主將馬林率數騎逃回開原。身為監軍的潘宗顏率眾頑強禦敵，“奮呼衝擊，膽氣彌曆”。終因寡不敵眾，明軍潰敗，潘宗顏戰死，死時“骨縻肢裂，慘不忍聞”。
其時，葉赫部軍兵正打算馳援馬林，突聞馬林兵敗，潘宗顏戰死，軍心動搖，不敢與後金兵交戰，不戰而逃。
其實，潘宗顏早已知馬林舞弄詩文尚可，指揮對敵則是外行，徒具虛名，並無將才。早在出師之前，潘就曾致書楊鎬，言：“林庸懦，不堪一麵之寄，乞易別帥當此重任，而以林遙作後應，庶其有濟。不然，不惟誤事，且恐此身實不自保。”如此重要的信息，楊鎬卻未予理睬。幾天後，潘宗顏之言果然應驗。
東路軍在驍勇善戰的劉綎的率領下，已深入後金軍陣地，並未得知兩路明軍兵敗的消息。為延緩劉綎軍前進的步伐，努爾哈赤下令在劉綎軍前進的路上砍斷大樹阻塞道路，設置了三道大路障，使劉綎軍行進十分艱難。其時，天寒地凍，氣候惡劣，明軍後方供給困難，沿途皆有明軍凍餓而死。
努爾哈赤坐鎮赫圖阿拉，指揮大貝勒代善、二貝勒阿敏、四貝勒皇太極前去迎戰劉綎軍。為將劉綎軍引入後金軍的伏擊圈，努爾哈赤利用杜鬆兵敗時繳獲的杜鬆令箭，派降順後金的漢卒冒充杜鬆軍卒，到劉綎軍前，假裝告急說：西路杜鬆大軍已抵達“奴酋”都城，急盼東路大軍並進，將敵城合圍，一舉將其拿下。
劉綎信以為真，唯恐杜鬆將軍拔得頭功，急令火速進軍，薑宏立率朝鮮援軍緊隨其後。這樣劉綎軍一步步進入到後金兵的伏擊圈內。待劉綎醒悟過來時，發現自己已陷入重圍。劉綎果然是個猛將，率軍死戰不退，後金軍竟一時攻打不下。此時朝鮮盟軍已投降，劉綎軍更加孤立。努爾哈赤命手下大將輪番上陣迎戰劉綎，代善、阿敏、皇太極率兵殺出，劉綎奮力死戰，身中數十箭，力竭而死，明軍潰敗。其子劉招孫救父苦鬥，也當場陣亡。剩下的明軍很快被後金軍殲滅，南路明軍也全軍覆滅了。
正當劉綎軍浴血奮戰時，李如柏本可以馳軍策應，但李如柏畏敵如虎，不敢增援，使劉綎孤軍奮戰，全軍覆沒。明朝四路大軍之間缺乏策應，各自為戰，經略楊鎬調度無方，是後金兵能夠從容地各個擊破的很重要的原因之一。
努爾哈赤再回軍準備消滅西南路明軍，卻撲了個空。李如柏雖為將門之子，卻膽小如鼠，一出兵就行動緩慢，故意落後。薩爾滸大戰已經結束，他才進至虎攔崗（今遼寧本溪市東）。這時坐鎮沈陽的楊鎬已得知前線大軍潰敗，急命李如柏退軍。李如柏接令如蒙大赦，急忙班師，明軍慌忙撤退，沿路遇後金小股部隊鼓噪，竟以為是後金主力部隊發起攻擊，驚恐潰逃，自相踐踏，死傷一千餘人。
至此，明四路大軍合朝鮮和葉赫援軍共十餘萬人征伐後金，以後金軍大勝和明軍慘敗而告終。薩爾滸之戰成為我國曆史上又一個以少勝多的戰例。
據《遼事實錄》記載，明軍在這場戰役中傷亡十分慘重，死於戰場的將領，約有三百餘名，士兵陣亡者共四萬五千八百七十餘名，騾馬槍炮輜重丟失無數。而金兵據說死亡不足二百人。明朝的遼東防線，全部為後金所突破。薩爾滸之戰是後金由弱轉強，明朝由強轉弱的轉折點。
薩爾滸大戰後，明軍再也不敢對後金主動發起攻擊了。努爾哈赤則乘勢攻占開原、鐵嶺，征服了葉赫部，完全掌握了遼東的戰略主動權，為清軍日後入關統一中國打下了基礎。