科赫經過無數次的試驗，最終找到了給結核病菌“穿衣服”的辦法。
原來，一般普通細菌隻要用苯胺一類染料，就能現出其原形了。可是結核病菌卻不吃這一套，普通苯胺不能染色。科赫終於摸索出一套新的辦法，就是用美藍這種染料加上乙醇酒精的溶液來染色，還需經過整整一天一夜，然後加熱到40°C，放1小時左右，再用別的化學藥品（如卡波品紅）去褪色。在一般情況下，普通細菌及組織染上的顏色都會褪去，變成棕黃色，而結核菌具有抗酸的能力，它不褪色。這樣一來，隻有它才能染成藍色，一眼就能看得出來，它是一種長條形的杆菌——結核杆菌。因為它有抗酸的能力，所以又叫抗酸杆菌。
科赫就是在這樣艱苦複雜的工作條件下，在1882年宣布他發現了結核杆菌的。
為了證實人體與動物的結核病都是受結核杆菌侵襲的結果，科赫設計了一套極為嚴密的論證方法。
他發現，有一些動物很容易受到結核杆菌的侵害，其中主要是豚鼠。
他首先從患結核病的組織中，取出一些組織，放在實驗室裏培養。經過精心培養後，從培養物中，科赫用染色的方法證明它們是結核杆菌。
然後，他把這些培養物提取出來，注射到健康動物體內。受注射的豚鼠過不多久就得病了。
它們的病狀與患結核病的病狀一模一樣。
接著，科赫把患病的豚鼠殺死，把有病的組織拿去培養，然後從培養出來的組織提出物中，用染色法檢查，直到找到與原先患病動物組織中找到的細菌相同的病菌為止。
這個全過程，叫做科赫氏假設，它包括：
患病動物組織培養證實致病微生物注射到健康動物體內引起同樣病症取出被接種的患病動物組織組織培養發現與原先發現的同樣細菌。
這個假設，後來成為細菌學中不可缺少的一個公式，可以用它證明某一種疾病是由於某一種病菌引起的。
在科赫以前，人們對癆病，也即結核病沒有統一的認識，對最常見的結核病，即肺結核，給它起了種種病名，有“慢性肺炎”、“肺尖卡塔爾”、“肺尖肺炎”等等。
經過科赫的研究，這些都是肺結核，是結核杆菌引起的。從那以後，這些雜亂的病名就不再用了。
科赫還正確地指出，結核菌不僅能侵犯肺髒，還能侵襲其他各種人體組織，這些組織包括腸子、骨骼關節、腎髒、皮膚、淋巴腺，從而導致腸結核、骨結核、關節結核、腎結核、皮膚結核和淋巴結核。
不僅如此，科赫還致力於研究治療結核病的方法。他設法從結核杆菌中提取出一種結核菌素，他先把這種結核菌素在試管裏試驗，又在實驗動物上試驗，看它是否能治療結核病。
可惜的是，經過一再驗證，結核菌素並不能治療結核病，但人們從科赫這個研究中得到了兩個啟示：一個是對任何傳染病的治療，必需先在試管裏試驗，然後再在患同樣疾病的動物內試驗，在取得肯定的結果後，才能過渡到人體治療。另一個是人們以同樣的原理，提取了抗白喉菌的血清，對於治療白喉病十分有效。
科赫在結核病方麵的研究，大大超過他在其他傳染病方麵的成就。
為此，瑞典的卡羅琳醫學院以1905年的生理學和醫學的諾貝爾獎授予給科赫。這是世界上在自然科學方麵的最高榮譽。
科赫成為現代的細菌學之父，他為現代細菌學製定了一整套的規範。這套規範一直到現在仍然為細菌學，特別是實驗室裏的細菌學所遵循著。其中包括細菌固體培養基、蒸汽消毒法、染色法、照相法以及塗取細菌培養液、玻片染色法等等，這些都是科赫當年所製定的規範。
科赫在1910年5月27日去世，享年67歲。他的骨灰安放在柏林傳染病研究所，而他用過的那台顯微鏡，仍然作為珍貴的文物珍藏在柏林大學。