當年，孫堅起兵討伐董卓，將家小全部移至舒縣。其子孫策與周瑜同歲，兩個人交好日密。後來孫堅去世，孫策繼承父誌，統率部卒。興平二年（195），淮南軍閥袁術派孫策率兵千餘人攻取江東，進至曆陽（今安徽和縣）時，周瑜得孫策來信，於是起兵響應孫策。孫、周二人協同作戰，先是攻下橫江渡、當利口，進而渡江攻擊地方勢力笮融、薛禮，占領了秣陵。接著又乘勝進軍湖孰、江乘二縣（均係長江下遊重要渡口，在今江蘇句容北），揚州刺史劉繇逃遁，孫軍進入曲阿（今江蘇丹陽縣）。
這時孫策已擁兵數萬，實力逐漸增強，並延攬人才，不斷兼並擴展。他審時度勢，決定脫離袁術，獨自向江東發展。他請周瑜渡江北返，回守當塗丹陽（今安徽當塗東北的小丹陽鎮）。
周瑜回到丹陽不久，袁術派堂弟袁胤取代他叔父周尚作丹陽太守，他便與叔父一同來到壽春（今安徽壽縣）。袁術見周瑜一表人才，又具有一定的軍事才能，欲收在自己帳下為其所用。然周瑜卻認為袁術鼠目寸光，且凶殘暴斂，料定他終究難以成就大業，於是婉言辭卻，請求改任居巢（今安徽巢縣）長。孫策追求進取，知人善任，使周瑜認定孫策是實現自己政治抱負的可依賴的英明之主。袁術不知周瑜本意，便同意了，而周瑜實際上是借路東歸，準備依附孫策。
漢獻帝建安三年（198），周瑜重歸孫策。孫策親往迎接，授予他建威中郎將，當即將士兵2000人，戰馬50匹撥給他指揮。此外，孫策還賜給周瑜鼓吹樂隊，替周瑜修建住所，賞賜之多，無人能與之比肩。當時，周瑜年僅24歲，年青英俊，風流倜儻，卻能對兵民施恩惠，對士大夫講信義，因此吳中人都稱他為“周郎”。
周瑜自從歸附吳國拜將之後，其聲名、威望更是與日俱增。孫策派他坐鎮牛渚（今安徽廬江縣南），不久又改派為春穀長，周瑜在此為孫策招募人馬、延攬人才，擴充兵力，積聚力量。不久，孫策準備奪取劉表控製的荊州，拜周瑜為中護軍，兼任江夏（三國吳時治所，在今湖北鄂城）太守，駐守巴丘。建安四年（199），隨孫策攻克皖城（今安徽潛山縣），獲劉勳部卒3萬餘人。後又進軍尋陽（今江西九江市），打敗廬江太守劉勳，再揮戈南取豫章（今江西南昌市）、廬陵（今江西吉水東北）等地，周瑜又奉命禦守巴丘（今江西峽江）。在征戰的曆程中，周瑜為輔助孫策開拓東吳疆域，創立東吳政權，立下了汗馬功勞。
建安五年（200），孫策在曹操與袁紹陳兵官渡之時，被吳郡太守許貢的門客殺死於丹徒（今江蘇鎮江）。臨終前，他將軍國大事托付給孫權，並命周瑜與長史張昭共同輔助孫權。周瑜奉令連夜率兵返吳（今江蘇蘇州）赴喪，臨危授命，開始參與輔政。
當時，孫權年僅18歲，江東的孫氏政權隻是初具規模，並不鞏固。因此統治營壘中不少人左瞻右顧，頓時形勢緊迫、人心惶惶。加之孫權已占據的江東六郡，還有許多偏遠險要的山區為山越人所控製，尚未臣服，北方的曹操、荊州的劉表都對此虎視耽耽，整個江東局勢難卜。在這個轉折的緊急關口，執事的周瑜和張昭，緊密地團結文臣武將，殫精竭慮，全心扶持，其他人才不敢輕舉妄動。
建安七年（202），曹操打敗了袁紹，兵威日盛，誌得意滿，以為天下可運於掌。於是命令孫權聽其節製，並立即將子弟送至許都作人質，欲使孫權集團不戰而降服。麵對曹操的脅迫，東吳眾臣無人敢抗拒曹令，這時周瑜挺身而出，他堅決反對送人質，他認為一旦按曹操的說法來辦，必然會受製於人。同時，周瑜通過正確分析曹魏和東吳的戰略形勢，並以昔日的楚國占據荊、揚二州而延續了數百年的曆史為據，勸說孫權不可向曹操降服。建議憑借長江天險，占據江南，抗衡曹操，靜觀天下大局的變化。孫權接受了周瑜的方略，拒派人質，決心割據江南，成王霸之業。
建安十一年（206），周瑜奉命督孫瑜等攻滅麻、保二屯（在陸口以東，陸口在今湖北蒲圻西北）的山賊。這次戰爭十分殘酷，周瑜將俘獲的部落首領一律斬首示眾，同時還把一萬多人強徙到江東政權的腹地。同年，江夏太守黃祖派部將鄧龍引兵數千人，進攻柴桑（今江西九江西南），周瑜率兵迎擊，生擒鄧龍凱旋而歸。建安十三年（208）春，周瑜被提升為前部大督，孫權領兵欲奪取荊州，以確保江東，然後向江南發展，再相機統一全國。這個戰略意圖在東吳軍隊擊殺黃祖、占據江夏的勝利基礎上得以初步實現。