第23章 動物實驗的基本技術方法(二)(2 / 3)

一般灌胃針頭插入長度小鼠為2.5~3.5cm,大鼠或豚鼠為3.5~5.5cm,常用的灌胃量小鼠為0.2~1ml,大鼠為1~4ml,豚鼠為1~5ml。

2.兔、貓和猴一般采用開口器和小兒導管或導尿管。開口器是以2cm×2cm×10cm 的木片或竹片,呈紡錘形,於正中垂直開一6~8mm直徑的圓孔製成。灌胃時,將動物固定於豎立體位,將開口器放於動物的上、下頜齒之間,兩端露出口角處,用繩將它固定或用手固定。右手持導管由開口器的小圓孔,沿咽後慢慢進入食管插入胃中,為防止插入氣管內,將導管外端插入盛水的小燒杯中,如隨動物呼吸而有氣泡冒出,表明送入氣管應立即拔出插管;若不冒氣泡,表明導管插入胃中,方可注入藥液,注入完畢,以少量清水衝洗殘留管內藥液,再撥出導管,為了避免將藥液誤灌入氣管和肺中,在經上述檢查後在灌胃時先向後抽動灌胃器,看是否有氣泡出現,並適當活動導尿管後再重複上法試驗,準確插入胃中後再灌胃。

3.犬給犬灌胃時,灌胃管可用12號十二指腸管或導尿管代替。也可用內徑0.3cm,長30cm軟膠皮管。如用開口器,開口器可用木料製成長方形,長10~15cm,粗細應適合犬嘴,為2~3cm,中間鑽一小孔,孔的直徑為5~10mm,灌胃時將開口器放於動物上下門牙之後,並用繩將它固定於嘴部,將灌胃管經開口器的小圓孔插入。也可不用開口器,灌胃時用12號灌胃管,左手抓住犬嘴,右手中指由右嘴角插入,摸到最後一對臼齒後的天然空隙,胃管由此空隙順食管方向不斷插入約20cm,可達胃內。不論是否用開口器,胃管插入後將另一端插入水中,如不出氣泡,並且輕輕轉動胃管後,注射器回抽也無氣泡,表示確已進入胃內,即可灌入。

(二)經口其他形式給藥

1.喂飼對於較大動物雖灌胃給藥劑量準確,但費時、費力,特別長時間反複給藥時,一次灌胃插錯灌胃管,就有可能導致動物死亡或被嗆住,出現肺部炎症。因此可考慮將藥物混入飼料或飲水中。水不溶的藥物可拌入飼料,溶於水的可溶入飲水中。但滲入飼料或飲水的藥物應屬不易揮發,不易破壞,不與食物起化學作用,沒有特殊的氣味等。雖此種給藥方式簡便易行,但存在最大問題是給藥量不準,各個動物服藥量差異較大。

2.經口滴入將動物保持相應的體位,用金屬或硬塑料管接上注射器,也可用吸管、移液管等,將藥物液體或混懸液滴入動物口腔,注意應送至咽部,讓其自行吞咽,為了不使滴入的藥液流出口外,可將藥物配成澱粉糊劑,在滴入口腔之後,可給予動物較喜愛吃的食料,如兔給些青菜,貓和犬給些肉類食物等,使滴入的藥物全部進入胃內。

3.經口吞咽將藥物按照一定劑量,事先裝在藥用膠囊內,直接送至動物口腔,為避免膠囊被動物咬碎或吐出,應將膠囊直接送至咽部,便於吞入。此法多適用於較大動物如兔、貓、犬等。

三、吸入給藥

吸入給藥方法也常見到,常用的有動式吸入給藥法和靜式吸入給藥法,主要是在染毒櫃內吸入給藥,有時亦可采用麵罩吸入給藥。根據實驗目的,亦可采用動式和靜式吸入染毒法的原理,進行生產現場或模擬吸入染毒試驗。吸入給藥也可采用氣管注入法給藥。如吸入乙醚麻醉動物,給動物定期吸入一定量的SO2或鋸末煙霧等可造成慢性支氣管炎動物模型等。

(一)動式吸入給藥(染毒)法

動式吸入給藥(染毒)是采用機械通風裝置、連續不斷地將新鮮空氣和藥物(毒物)送入染毒櫃,並排出等量的汙染氣體,使染毒濃度相對穩定。染毒時間亦不受染毒櫃的氣積限製,可避免實驗動物缺氧、二氧化碳積聚、溫度增加等的影響。因此,動式吸入染毒適用於一次較長時間的染毒和反複染毒的慢性實驗。但是應用此法需要有一套發生毒物、控製濃度和含毒空氣的淨化裝置,實驗用毒物的消耗量亦較大。可適用急性、亞急性和慢性實驗。

所用設備包括染毒櫃、毒物發生係統和機械通風係統3個部分。染毒櫃為實驗動物染毒時放置動物用;毒物發生係統包括霧化器、流量計等;機械通風係統包括馬達、離心式鼓風機、過濾器等。

1.染毒櫃的基本要求和結構染毒櫃要一定的容積,以便安放足夠動物數目。一般可取實驗動物總體重(kg)乘50~100來計算,如采用40隻大鼠做染毒,每鼠重250g,則總體重為10kg,再乘以50~100,染毒櫃容積為0.5~1m3.

染毒櫃材料與受試物應不起反應和易於清洗;要能觀察動物中毒症狀和便於放取動物,有進出氣口、采樣孔、有溫度、濕度和壓力測定裝置;櫃體要密閉,一般染毒櫃為圓錐形,櫃內溫度在20~30℃,同一天內變動範圍最好在3℃以內,濕度以50%~70%為易,櫃內風速應在0.2m/s左右。

2.毒物發生係統揮發性液體的發毒方法有鼓泡法、混合法、噴霧法等。鼓泡法是讓空氣通入揮發性液體產生的氣泡促進液體蒸發,並由空氣攜帶一定量的蒸氣,再送入染毒櫃;混合法是將揮發性液體蒸氣與空氣混合並稀釋到一定濃度進行染毒;噴霧法是用霧化器將液體霧化後噴入染毒櫃;也可采用趨聲霧化器對受試液體進行霧化。

一般櫃內每小時換氣3~10次,櫃內CO2濃度不應超過0.5%。

3.染毒濃度的計算

揮發性液體染毒濃度(mg/m3)=(a×d)/V×1000

a為實驗期間消耗毒物的總量(ml),d為毒物的密度,V為實驗期間補充(或排出)的總風量(m3)。

氣體染毒濃度(ppm)=L/V×1000

L為實驗期間消耗毒氣的總容量(升),V為實驗期間補充(或排出)的總風量(m3)。

4.注意事項染毒櫃內上下左右各點的濃度要均勻一致,誤差不宜超過20%,應避免皮膚對毒物的吸收,對照組除不吸入毒物外,也應放在染毒櫃內,其他條件與染毒組相同。

(二)靜式吸入給藥(染毒)法

本法是將實驗動物放在某一氣積的密閉容器內(染毒櫃),加入一定量的毒物,造成一定濃度的含毒空氣,在規定時間內觀察實驗動物的反應。

實驗動物在呼吸時消耗氧,隨著染毒時間的延長染毒櫃內含氧量下降,二氧化碳濃度相應增加;時間過長,動物可出現缺氧和二氧化碳瀦留的症狀;在染毒過程中,動物皮毛、排泄物及染毒櫃壁可吸附一定量的毒物,毒物的分解及動物經呼吸道吸收,櫃內毒物可逐漸降低。這些因素對實驗結果可帶來一定影響。雖然本法存在這些缺點,但設備簡單、操作方便、消耗毒物少,隻要注意控製實驗條件,仍有價值。染毒櫃所需氣積也可按實驗動物總體重(kg)×100×染毒時間(小時)來估算。為減少實驗動物缺氧和二氧化碳的影響,染毒櫃內氧含量不應低於19.0%,二氧化碳含量不應超過1.7%。

幾種實驗動物所需氣積,按每隻動物每小時所需氣積(L),小鼠3L,大鼠30L,家兔(2~3kg)250L,猴(3~4kg)300L。

1.染毒裝置染毒櫃與動式基本相同,也可用簡易裝置,一般要求10min內毒物蒸發(霧化)完畢,達到一定實驗濃度,一般急性吸入染毒多采用2h。

2.染毒濃度的計算

染毒濃度按C=(a-d)/L×1000

C為染毒濃度(mg/L),a為加入毒物(ml),d為加入毒物的密度,L為染毒櫃的容積(L)。

(三)麵罩染毒法和吸入染塵法

觀察毒物吸收、分布、轉化規律可采用口鼻罩吸入染毒法,可根據染毒不同要求來選擇發毒裝置,如蒸氣可用霧化器,粉塵采用揚塵器,氣體可稀釋後染毒。

粉塵狀毒物可用發塵室內吸入或氣管注入法。粉塵狀毒物顆粒大小一般應控製在5μm 的以下,其中大多數應在2μm的以下。

(四)氣管注入法

經氣管注入毒物是觀察毒物經呼吸道進入機體的方法之一。其優點是,方法簡單易行,不需複雜設備;染毒劑量較準確;形成中毒或塵肺病理模型速度快;用毒物量少。其缺點為氣管注入與自然吸入的毒作用可能有差異,不能發揮上呼吸道的自衛作用;操作易造成損傷,如操作不當可致動物窒息甚至死亡。故此法一般僅限於急性染毒實驗,不宜用做慢性染毒或染塵。

氣管注入法可采用經喉插入法、氣管穿刺法、暴露氣管穿刺法3種方法。大鼠、豚鼠多采用經喉插入法;兔氣管較粗,多取氣管穿刺;氣管內注入的藥液容量,大鼠和豚鼠不宜超過1.5ml,兔約為5ml,小鼠應少於0.2ml。

四、經皮給藥

動物的皮膚在解剖上和功能上均與人的皮膚有較大差別,對毒物作用的反應與人的皮膚最相近似的是家兔、豚鼠及豬,因此常用這些動物做實驗,有時也用大鼠塗皮及小鼠做浸尾實驗。

家兔、豚鼠和大鼠經皮染毒,需要對染毒部位皮膚先行脫毛,脫毛的部位、麵積視不同動物和實驗要求而定。常用塗藥麵積大鼠和豚鼠為4~5cm,家兔為10~15cm2,小鼠為2~2.5cm2,去毛麵積占體表麵積的10%~15%。染毒部位一般為脊柱兩側的軀幹中間部分皮膚,大鼠有時選用腹部。

五、其他途徑給藥

(一)滴鼻給藥、口腔給藥和滴耳給藥

1.滴鼻給藥一般用成年豚鼠或大白鼠,雌雄各半,體重200g左右,一般設2個劑量組,並設賦形劑(或空白)對照組,每組10隻動物,若預試大劑量組不引起死亡時,也可隻設一個高劑量組。接受試物臨床用的劑型(或不同濃度)給動物滴入鼻中(滴鼻體積一般不超過02ml/kg,為確保完全進入鼻腔,滴鼻後用手將大鼠仰臥固定1min),至少接觸4h(如受試物漏出,則在4h內平均分次給藥),觀察受試動物給藥後24h全身狀況及局部黏膜的變化,然後處死部分動物取出呼吸道黏膜組織觀察,部分留存動物觀察至第7天,再處死檢查。若在實驗觀察中出現明顯毒性變化時,則應在死亡或存活處死動物中觀察主要內髒和呼吸道(鼻、喉、氣管、支氣管)黏膜的變化,並做病理組織學檢查。一般應列表報告分組情況、劑量、用藥次數、全身症狀及局部刺激症狀(如有哮喘、咳嗽、嘔吐、窒息等症狀出現,應報告發生時間及次數)。詳細寫明用藥24h、48h及停藥7天後鼻、喉、氣管、支氣管等呼吸道黏膜的病理解剖學變化,有死亡動物時應報告死亡時間、中毒症狀及呼吸道和主要內髒的病理組織學變化。

2.口腔用藥、滴耳劑可參照滴鼻劑給藥。病理解剖學及病理組織學檢查改為口腔、喉(或外耳道、鼓膜)及主要內髒。

(二)直腸和陰道給藥

一般選用成年家兔或大鼠,家兔體重2.5kg左右,大鼠0.25kg左右,一般設2個劑量組,並設賦形劑(或空白)對照組,每組10隻動物,若預試中高劑量組未出現動物死亡,也可設一個高劑量組,進行直腸(陰道)給藥的毒性及刺激性觀察。

受試物與動物直腸或陰道接觸至少4h(如有漏出應在4h內平均分次給藥),觀察給受試物後至24、48h的全身狀況及局部刺激反應。24、48h後處死部分動物,取直腸或陰道,觀察黏膜有無充血、水腫等變化,並做病理組織學檢查,與對照組比較。部分留存動物逐日觀察並記錄其全身狀況、體重、呼吸、循環、中樞神經係統及四肢活動等變化。第7天處死動物檢查直腸或陰道的變化。若在實驗觀察中動物出現中毒反應或死亡,則應在死亡或存活處死的動物中觀察主要髒器,並做病理組織學檢查。

一般應列表說明分組情況、劑量、動物數、觀察期間動物的體重變化及全身症狀,寫出24h後及7天後局部組織的病理組織學檢查報告。如有死亡或嚴重中毒,應報告發生的日期及主要髒器的病理組織學變化。

直腸給藥時一般用導尿管或灌腸用的膠皮管,在膠皮管或導尿管頭部塗液體石蠟,由助手使兔蹲臥於桌上,用左臂及左腋輕輕按住兔頭及前肢,以左手拉住兔尾,露出肛門,並用右手輕握後肢,實驗者將橡皮管插人家兔肛門內,深度7~9cm,橡皮管插好後,將注射器與橡皮管套緊,即可灌注藥液。家兔陰道給藥也可用此法,插入深度為2cm左右,但應注意無論直腸給藥或陰道給藥,體積不易過大,並應注意和防止藥液流出,以免給藥量不準。

(三)小腦延髓池給藥

此種給藥是在動物麻醉情況下進行的,而且常采用大動物如犬等。將犬麻醉後,使犬頭盡量向胸部屈曲,用左手摸到其第一頸椎上方的凹陷(枕骨大孔),固定位置,右手取7號鈍針頭(將針頭尖端磨鈍),由此凹陷的正中線上,順平行犬的方向,小心地刺入小腦延髓池。當針頭正確刺入小腦延髓池時,注射者會感到針頭向前穿時無阻力,同時可以聽到很輕的“哢嚓”聲,即表示針頭已穿過硬腦膜進入小腦延髓池,而且可抽出清亮的腦脊液,注射藥物前,先抽出一些腦脊液,抽取量根據實驗需要注入多少藥液決定,即注入多少抽取多少,以保持原來腦脊髓腔裏的壓力。

(四)腦內給藥

此法常用於微生物學動物實驗,將病原體等接種於被檢動物腦內,然後觀察接種後的各種變化。小鼠腦內給藥時,選套有塑料管,針尖露出2cm深的5號針頭,由鼠正中額部刺入腦內,注入藥物或接種物。給豚鼠、兔、犬等進行腦內注射時,須先用穿顱鋼針穿透顱骨,再用注射器針頭刺入腦部,再徐徐注入被檢物,注射速度一定要慢,避免引起顱內壓急驟升高。

(五)關節腔內給藥

此種方法用於關節炎的動物模型複製。兔給藥時,將兔仰臥於兔固定台上,剪去關節部被毛,用碘酒或乙醇消毒,然後用左手從下方和兩旁將關節下後方傾斜刺進,直至針頭遇阻力變小,然後針頭稍後退,以垂直方向推到節腔中,針頭進入關節腔時,通常可有好像刺破薄膜的感覺。表示針頭已進入膝關節腔內,即可注入藥液。

第九節 實驗動物血液的采集方法

在動物實驗中常需對生物樣品如血液、膽汁進行檢測或檢查,故必須掌握實驗動物生物樣品的采集、分離和保存的操作技術。

一、實驗動物血液的采集

各種實驗動物的采血部位與方法,與動物種類、檢測目的、實驗方法以及所需血量有關。常用的采血部位有眼眶靜脈叢采血、鼠尾靜脈采血、斷頭采血、心髒采血、腋下靜脈采血、頸靜脈(動脈)采血、腹主動脈采血、股動脈采血、耳靜脈采血、後肢外側小隱靜脈和前肢內側皮下靜脈采血等。