3.異種體細胞克隆階段異種體細胞克隆是將一種動物的體細胞核移植到另一種動物的去核（遺傳物質）卵母細胞中。由於瀕危物種的個體數量少，很難提供用於克隆的卵母細胞和代孕受體，這就促使科學家提出了異種克隆的設想。異種克隆研究麵臨著許多問題，如體細胞核能否在異種卵胞質中去分化並支持早期胚泡發育，異種核質能否相容，異種重構胚能否著床並進行全程發育等問題。這些問題的探討有利於充實細胞生物學、發育生物學、生殖生物學、免疫學和信號轉導等研究領域的理論。
我國克隆動物研究近幾十年來取得了很大的成績。20世紀60年代，生物學家童第周對金魚、鯽魚進行細胞核移植。1990年5月，西北農業大學畜牧所克隆山羊成功。1992年，江蘇農科院克隆一隻兔。1993年，中科院發育生物學研究所與揚州大學農學院合作，克隆一隻山羊。1995年7月，華南師範大學與廣西農業大學合作，克隆一頭奶牛、黃牛的雜種牛。1995年10月，西北農業大學畜牧所克隆6頭豬。1996年12月，湖南醫科大學人類生殖工程研究室克隆6隻老鼠，中國農科院畜牧所克隆一頭公牛犢。1999年6月，中國科學院動物研究所研究員陳大元率領的研究小組，通過將大熊貓體細胞植入去核後的兔卵細胞中，成功地培育出了大熊貓的早期胚胎。同年10月，中科院動物研究所和福州大熊貓研究中心合作，首次培植成功異種克隆大熊貓早期胚胎，這表明我國的大熊貓研究再次走到世界前列。2000年5月，我國科技人員利用胚胎克隆出2隻小白兔。2000年6月，西北農林科技大學生物工程研究所培育出世界上第一例成年體細胞克隆山羊。
（二）克隆動物的研究現狀
體細胞克隆經過幾年的發展，已經誕生了多種哺乳動物的克隆後代。以下簡要綜述各種動物克隆的現狀。
1.綿羊第一次用分化細胞做供體克隆成功的動物即為綿羊。1996年，Campbell等用體外培養的已發生分化的胎仔的胚盤細胞獲得了克隆綿羊。這是動物克隆的重大突破，使人們相信分化一定程度的細胞可以去分化。1997年，來自乳腺細胞的克隆綿羊“Dolly”的誕生，實現了幾代科學家的夢想，並直接推動了全球大規模的克隆研究的進程。同年，Schnieke等利用轉基因技術，將Human Factor IX基因轉染胎仔成纖維細胞，以此為供體得到了第一批攜帶外源基因的克隆綿羊。2000年，McCreath等利用基因打靶技術，得到定點整合外源基因的克隆綿羊。2002年，Loi等將顆粒細胞於55℃加熱滅活，隻將保持完整核小體結構的細胞核注入到去核卵母細胞中，最終得到來自滅活細胞的克隆綿羊。這一實驗驗證了核移植先驅Marie DiBerardino的理論：體細胞核移植的理想境界是隻有DNA、蛋白質複合體及有功能的中心體被導入受體胞質。這是哺乳動物中首例支持這一說法的實驗，為拯救瀕危物種甚至複活已滅絕的物種展示了光明的前景。2001年，Loi等以綿羊卵母細胞為受體，經異種核移植，成功地得到了瀕危的歐洲盤羊的克隆後代。
2.牛牛作為最常見、與人們生活密切相關的家畜，從一開始即受到克隆學家們的重視。目前得到的克隆牛已初具規模，早期的克隆牛已正常產仔。作為克隆研究的材料，牛有許多優點，如材料來源廣、卵母細胞接受性強、研究成果可直接用於生產等，人們利用牛做了大量的理論及應用研究。1998年，Cibelli等利用體外培養的攜帶了外源基因的胎仔成纖維細胞，得到表達p-半乳糖苷酶的轉基因牛。緊接著，日本得到了來自輸卵管上皮細胞的克隆牛。此後，新西蘭、法國、德國等都得到了克隆牛。我國的克隆牛實驗也取得了很大進展。2001年，中國農業大學陳永福教授等將國外構建的克隆牛胚胎，移植入國內受體母牛，獲得了克隆牛犢。2002年初，中科院動物所的陳大元研究員領導的實驗小組與山東中大胚胎工程中心合作，獲得首批來自成年牛耳成纖維細胞克隆牛，這是國內首次獨立完成的克隆牛實驗。迄今為止，已有胎仔成纖維細胞、耳成纖維細胞、顆粒細胞、肌細胞、乳腺上皮細胞、子宮上皮細胞、肝細胞、輸卵管上皮細胞等用於克隆牛並取得了成功，克隆牛後代已初具規模。2001年，美國ACT公司對他們得到的24頭克隆牛的近況做了報道：24頭克隆牛已經性成熟，在遺傳、免疫等方麵未發現異常，且人工受孕成功。克隆牛中一個值得注意的現象是日本黑牛的克隆，其克隆效率高達19%，而其他的克隆牛效率不超過5%。分析發現該方法與其他克隆方法有所不同，在得到的38枚克隆囊胚中，他們隻選擇了其中的10枚移植入受體中，得到8頭克隆小牛，存活4頭。這就提出了一個問題，即是否可以通過選擇胚胎來提高克隆效率。2001年，Urakawa等又報道了這種牛更高的核移植成功率。他們對95枚卵母細胞進行了核移植，其中27枚發育到致密桑葚胚。移植其中的6枚後，得到4頭成活的克隆牛。照這樣計算，若所有胚胎質量相同，將意味著19%的核移植卵母細胞可發育為克隆後代，這是目前其他動物無法實現的效率。這種高效率究竟是胚胎選擇的結果還是物種的原因，現在仍不明朗。因此，闡明日本黑牛克隆高效率的原因將為提高動物克隆的效率提供有價值的信息。
3.小鼠小鼠因其生殖周期短，飼養空間小，材料來源較容易，因此成為最常用的實驗動物。“Dolly”羊誕生以後，人們開始致力於小鼠的克隆。但小鼠的克隆方法卻有別於綿羊。第一隻克隆小鼠的核移植借助於一種壓電裝置的設備。1998年，Wakayama等報道了用此裝置，借助瞬間高壓，將卵丘細胞核迅速導入卵母細胞中，得到了第一批克隆小鼠。此後，用此方法得到了多批克隆小鼠。2000年，Ogura等用電融合的方法，將小鼠尾尖細胞導入卵母細胞中，得到了克隆後代，這突破了小鼠克隆的技術限製。2001年，Ono等以同步於M期的小鼠胎仔成纖維細胞為供體核，移植並在原核期將原核移入去核的受精卵中，得到了2個核移植後代。2002年，Hochedlinger等以B、T淋巴細胞為供體，得到克隆囊胚，經培養得到來自克隆胚胎的ES細胞，然後將此ES細胞注射入四倍體囊胚腔，得到來自B、T淋巴細胞的克隆後代，這是動物克隆中的重大事件，它有力地說明了終端分化細胞可以去分化，恢複全能性，也證實了克隆動物至少有一部分來自分化的體細胞。
4.豬豬是又一種重要的家畜，也是目前認為最適合用來生產用於移植的人類器官的動物。因此，對豬的克隆研究很早就已開展。但由於豬是多胎動物，每隻受體需要移植多枚重構胚才能誘導妊娠，對克隆工作造成一定的困難。直到2000年，科學家們用不同的方法得到了三批克隆豬。Onishi等利用顯微注射的方法，將胎仔成纖維細胞注射到卵母細胞中，經體內發育得到一頭克隆小豬。Polejaeva等用2次連續核移植，得到5頭小豬。這以後，豬成為研究動物克隆的重要模型。豬的器官被認為是有可能作為人類器官的代用品。因此，豬的克隆的應用研究很活躍。2001年，Park等報道，他們將攜帶有綠色熒光蛋白基因的皮膚成纖維細胞，導入去核卵母細胞中，得到了表達有綠色熒光蛋白的克隆豬胚胎。2002年，Lai等將綠色熒光蛋白基因導入胎仔成纖維細胞，並用G2/M期細胞做供體得到表達綠色熒光蛋白的克隆小豬。
5.山羊山羊的克隆成功較早。1999年，Baguisi等得到了表達人的antithrombin III基因的轉基因克隆山羊。我國科學家於1999年得到了來自胎仔成纖維細胞的克隆山羊，隨後又得到了兩批來自卵丘細胞和胎仔成纖維細胞的克隆山羊。Keefer等也於2001年和2002年得到兩批來自胎仔成纖維細胞和顆粒細胞的克隆山羊。
6.兔雖然第一隻體細胞克隆兔於2002年誕生，但兔的克隆曆史並不短。人們利用胚胎細胞為供體得到過克隆兔。1992年，Yang等以16～32細胞期的胚胎細胞為供體，得到克隆兔。2002年4月，Chesne等報道了體細胞克隆兔的成功。隨後，Matsuda等用攜帶外源基因的體細胞為供體，得到轉基因的克隆兔。
7.貓貓是一種不太常用的實驗動物，對其生殖生理的研究不如其他動物充分，克隆貓的誕生比較晚。2002年，Shin等得到了來自卵丘細胞的克隆貓。這隻貓的誕生並不順利。他們先用雄性成纖維細胞為供體，得到188枚胚胎，將其中的86枚移植入受體，得到一例妊娠，但不久後停止發育。後來，又以卵丘細胞為供體得到了成活的克隆貓。但這隻小貓在出生後2個月死亡。
二、克隆技術的原理和方法
目前哺乳動物的克隆方法主要有胚胎分割和細胞核移植2種。細胞核移植又包括胚胎細胞核移植、體細胞核移植、幹細胞核移植等。
（一）胚胎分割
胚胎分割是把一個胚胎分成2組或多組，經過短暫培養使其修複、發育，再一同或分別移到不同的代母中妊娠產多仔，這種技術又稱為人工同卵多胎技術。這是一項成倍或數倍地增長經濟遺傳性狀優秀動物的數量和迅速提高畜禽生產質量的技術。應用這項技術可以人為地把胚胎分割成2個或幾個，移植給受體動物，可獲得一卵雙胎甚至多胎，比起移植未分割的整胚，產仔率可大大提高。胚胎分割技術可以對遺傳學、發育生物學、營養學、生理學以及動物育種學等研究提供非常寶貴的材料。人們可以不用考慮遺傳背景去研究各種因素對動物的影響。胚胎分割是胚胎移植中擴大胚胎來源的一個重要途徑。目前已被用於產生許多同卵雙生後代。分割後的2枚半胚，即使性別不明，也可移植給同1隻受體動物，而不會產生異性孿生母犢不育的問題。在我國胚胎分割成功的有：小鼠（1986年，西北農業大學），奶牛（1987年，中科院遺傳所、四川鳳凰山乳牛場），山羊（1987年，西北農業大學），綿羊（1987年，中科院畜牧所），兔（1990年，西北大學、中科院發育所）。
胚胎分割有2種方法，一種是用顯微操作儀上的玻璃針（或刀片），將每個卵裂球分離或半胚進行切割，分別放入一空的透明帶中，然後進行移植。1979年，英國劍橋大學的威拉德森采用這種方法成功克隆出了4隻羔羊。他先用吸管從卵裂球的中間將卵裂球吸住固定，再用特製的玻璃針刺破透明帶，並插入其中，把胚胎推向一邊，繼續進針，直刺向被吸管吸住的透明帶部位。接著挑開透明帶，再用操作吸管取出裸露的胚胎，迅速放入培養皿中切割。在切割前，先用吸管反複抽吸、吹打裸露的卵裂球，使卵裂球內細胞間的內聚力逐漸減弱，使各個卵裂細胞鬆動。然後用一根玻璃針切割卵裂球，把完整的卵裂球分成2個半胚。當分割完成後，立即用注射吸管吸住空透明帶，裂口處於垂直位置，把要注入的分割胚胎吸入注射吸管內，再把注射吸管的前端插入裂口內，並把分割胚胎分別放入透明帶中，用瓊脂把分割胚胎包埋2次。最後，威拉德森還得為這樣處理過的胚胎請“臨時保姆”，他先把這種胚胎放入家兔的輸卵管內，由於停留時間過長，使得胚胎的活力減弱，最後還是請綿羊做“臨時保姆”，直到分割胚胎順利地發育到囊胚期，再將它移入“代理母親”的體內，如果胚胎發育正常，這位“代理母親”便可以臨產分娩了，誕生的便是由胚胎細胞克隆而生的動物。另一種方法是用顯微操作儀上的玻璃針（或刀片）或徒手持玻璃針將桑葚胚或囊胚一分為二或一分為四，並把每塊細胞團移入空的透明帶內，進行移植。目前也可不裝入透明帶中，直接進行移植。