6.流感病毒屬於正黏液病毒屬。動物模型最好選用雪貂,也可用小鼠、金黃地鼠、豚鼠、猴及豬。
7.麻疹病毒除靈長類動物外,一般動物均不易感。1911年首次成功的傳給獼猴,以後證明,除了接種和吸入外,其他種類的猴,如猿類、恒河猴、爪哇猴、矮猴等,對各種不同接種途徑也易感染。其症狀類似人類麻疹。潛伏期為2~3天,病毒血症期為4~15天,約一半動物有皮疹、結膜炎、卡他症狀和發熱。
適應在組織培養上的病毒可在乳鼠或乳地鼠體內繁殖,腦內接種可引起腦膜炎症狀。
8.呼吸道合胞病毒猩猩感染後可產生與人一樣的上呼吸道臨床症狀。猴,如Cebus 猴感染本病毒後,可引起肺炎,在肺和支氣管都可以找到呼吸道合胞病毒抗原。Cobues 猴感染後4~6天,病毒繁殖方可達到高峰,並出現臨床症狀。地鼠和棉鼠對呼吸道合胞病毒較敏感,感染後,在其細支氣管及肺可以找到呼吸道合胞病毒。
9.狂犬病毒(rabies virus)Galfiev首先用家兔作為實驗動物,進行了傳統的實驗,在該實驗中,巴德斯培育了對犬致病力減弱而對家兔具有固定潛伏期的毒株。實驗室感染實驗,常選用中國地鼠、小鼠、豚鼠和兔(按敏感性程度排列)。顱內接種比皮下或肌內注射更可靠。
10.天花病毒猴及家兔均敏感。應選用雄兔做皮膚劃痕接種、角膜劃痕接種、睾丸內接種。猴則在脅腹部皮膚上做劃痕,如係雄猴則同時做睾丸內接種。感染後兔皮膚劃痕處出現明顯的皮疹,輕微角膜炎,無睾丸炎;猴沿皮膚劃痕出現典型皮疹,如做睾丸內接種,則有睾丸炎發生。
11.單純皰疹病毒(HSV)家兔為最適宜的動物,豚鼠、小鼠、地鼠也可用。用家兔及豚鼠的原因之一,是因為可以用有菌材料做角膜接種而可不加抗生素或過濾,不妨礙病毒生長。
12.水痘病毒帶狀皰疹(VZV)、巨細胞病毒還未發現有實驗動物對這2種病毒敏感。
13.甲型肝炎病毒(HAV)絨猴、黑猩猩、紅麵猴對HAV均易感,經口或靜脈注射接種病毒後,可產生肝炎。盡管黑猩猩和絨猴對甲型肝炎病毒具有易感性,人工感染可使其發病,而且在感染的肝細胞漿中也能檢出病毒顆粒,但是,它們會自糞便中排出病毒顆粒,應十分小心。
14.乙型肝炎病毒(HBV)黑猩猩與長臂猿、狒狒等其他非人靈長類動物相比,對人的乙型肝炎病毒更易感。但該動物價格昂貴,且不易獲得,不可能進行大批量的動物實驗。樹鼩對人的乙型肝炎病毒感染率較高,且可形成一定的肝髒病理改變,但是卻不能長期攜帶該病毒。與上述2種動物相比,豚鼠具有一定的實用價值。豚鼠可作為研究乙型肝炎慢性化和免疫耐受機製、整合病毒基因在肝細胞癌發生過程中的作用、Delta聯合感染和重疊感染的機製、乙肝疫苗研製和抗病毒化療藥物的篩選等的模型材料。這些研究在人體需觀察20~30年,在豚鼠僅需2~4年。
十三、老年病研究中實驗動物的選擇與應用
隨著社會的發展,人類的平均壽命亦越來越長,老年人在總人口中的比例不斷增加,老年病研究已成為生物醫學研究的重要課題。在老年病研究中,對實驗動物來說,應重點解決建立研究人類的老化用實驗動物模型;積累各種實驗動物的正確而詳細的生物學資料;供應為老化研究用的實驗動物,特別是老齡實驗動物。
目前,用於老年醫學研究的實驗動物以哺乳類動物為主,有小鼠、大鼠、豚鼠、兔、犬、豬、猴等,其中大鼠使用最多,並廣泛用於各種項目的研究,其中以細胞生物化學、消化器官、激素、酶等研究為主。小鼠的使用數雖比大鼠低,但用途廣泛,以放射線、消化器官、免疫、酶等的研究為主。鳥類的使用率不高,但涉及的研究項目很廣。魚類、兩棲類、爬蟲類以及無脊椎動物等,絕大多數被用於比較生物學的研究。
老年醫學研究中實驗動物選擇應注意下麵幾個問題。
(一)老年學實驗研究中實驗動物的選擇原則
選擇原則:①有明確的生命期限,確知使用時的壽命;②具有與人類相似的生長發育、繁殖和衰老的生命階段;③對感染和傳染病有一定的抵抗能力;④食物內容和營養條件與人類相似;⑤能夠施行多種檢測指標進行檢驗;⑥染色體的分析方便易行。
(二)應注意人、實驗動物的壽命及各種動物間壽命的相應時間
老齡實驗動物可依據動物的牙齒磨損程度、外形顏色、趾爪長度及厚度、眼睛的蒙矓程度、毛色色澤、行動遲緩程度等來判定。雌性大鼠和小鼠可檢查其陰道塗片的細胞學變化,如連續檢查3個動情周期均無規律性的細胞學變化,即表示其已進入老齡。
(三)應注意選擇標準化的實驗動物
在進行老年醫學研究中應充分考慮所用實驗動物的生物學狀態,即遺傳基因型、表現型、演出型。應盡量選擇經遺傳檢測、微生物檢測、營養檢測、環境檢測合格的標準化實驗動物。最常被選用的是各種品係的小鼠和大鼠。在選用時應了解各品係小鼠或大鼠的生物學特性和壽命期限。
(四)應注意選擇適合老化研究特殊需要的實驗動物
1.老化研究的小型豬豬在生理學研究中,特別是在循環係統的研究上,是極好的模型動物。但由於豬體形過大,給實驗操作帶來不便。小型豬基本上達到了老化研究用實驗動物的基準,成為理想的實驗動物。小型豬的壽命大致和普通豬相同,其生理學性質與人相似。由於小型豬早期就可患自發性動脈硬化症,故已成為研究動脈硬化症的極為理想的實驗動物。另外,豬還常用做包括心律不齊研究在內的人體循環係統的模型,並可用於腎功能、胰、皮膚、繁殖、體溫調節等的研究,它還具有與人類風濕性關節炎極為類似的自發性的胃潰瘍病。
2.老化研究的裸小鼠為了能看到老化進展狀態,很多研究者都用裸小鼠進行觀察。如果把此種裸小鼠飼養在無菌或SPF環境中,也可與正常小鼠同樣發育而不患消耗性疾病,壽命也與正常小鼠相同。由此可知,消耗性疾病並不是由胸腺缺乏直接引起的,而是由感染引起的繼發變化。因此,對以往著眼於胸腺和老化之間關係進行研究的消耗性疾病,有進一步探討的必要。由於裸小鼠胸腺缺損,是研究胸腺和年齡之間關係的最合適動物。
3.老化機製研究的豚鼠關於老化的遊離基學說——過氧化脂質學說,雖也常用大鼠和小鼠,但必須根據研究目的選擇合適的實驗動物。例如,研究腎上腺脂質的過氧化時,幾乎不可能在大鼠的腎上腺中證實;而在豚鼠中,卻能隨著年齡的增長,檢測其脂質過氧化物的增長狀況。
第四節 影響動物實驗的因素
一、動物實驗的概念
動物實驗是現代醫學研究中常用的方法,是進行教學、科研和醫療工作必不可少的重要手段和工具。動物實驗是根據實驗目的,恰當地選用標準的並符合實驗要求的實驗動物,在設計的條件下,進行各種動物實驗,觀察、記錄動物的反映過程與反映結果,以探討或檢驗未知因素對生命活動的作用與影響。
動物實驗可用如下公式表示:
R=(A+B+C)×D+E
R:實驗動物的總反應或演出型。
A:動物種間的共同反應。
B:動物品種、品係特有的反應。
C:動物的個體反應。
D:環境因素(包括實驗處理)引起的反應。
E:實驗誤差。
要想獲得正確可靠的動物實驗結果,就必須了解影響動物實驗結果的各種因素,排除各種影響實驗結果的幹擾因素,對動物實驗質量和動物實驗各環節實行控製。
A、B、C是相對已知的,由動物本身的遺傳因素決定的,應正確的選擇實驗動物,在嚴格控製環境因素和實驗處理因素D條件下,改變其中某一條件後探索或檢驗出實驗處理因素與機體內在的特殊聯係,從而得到可信的實驗結果R。
影響動物實驗結果和數據變動的因素是多方麵的,但主要有遺傳因素、環境因素、動物實驗因素和實驗誤差等因素。其中環境因素,包括營養因素和微生物因素已在前麵各章中進行了論述,不再重複。
二、遺傳因素對動物實驗的影響
不同種屬的哺乳類動物,其生命過程有一定的共性,這正是科學實驗中可以應用實驗動物的基礎。但另一方麵不同種屬的動物在解剖、生理生化特征和各種反應上又有個性。例如,某種致病因素對一種動物是致病的,而對另一種動物可能完全無害。因此熟悉這些種屬差別有利於動物實驗的進行。如犬、猴、貓對嘔吐反應敏感,適宜做嘔吐實驗。兔和豚鼠嘔吐不敏感,大小鼠無嘔吐反應。大鼠是致畸最敏感動物。豚鼠對過敏實驗適宜,它的耳蝸對聲波變化十分敏感,可做聽覺實驗。家兔對致熱物質十分敏感,可用於發熱,解熱和致熱原的研究。兔是誘導排卵的動物,適宜做藥物對排卵影響的實驗。
同種屬不同品係的動物對同一刺激的反應也有很大差異。如DBA/2小鼠100%可發生聽源性癲癇發作,而C57BL/6小鼠根本不出現這種反應。AKR為高發白血病品係,C3H小鼠乳癌發病率為97%,C57BL/6屬低癌組。A係與BALB/c兩個品係在存活期、自發腫瘤、對藥物反應和生殖發育上都有顯著差異。BALB/c和C3H小鼠對鼠傷寒沙門菌的敏感性存在顯著差異,不同來源的Swiss小鼠對仙台病毒的敏感性也不同,不同品係實驗動物對微生物感染的抵抗力也不同,如小鼠對細菌感染的抵抗力就存在品係差異。
在不同種屬動物身上做的實驗結果也有較大差異。由於不同種屬動物的藥物代謝動力學不同,對藥物反應性也不同,所以藥效就不同。主要表現為:①吸收過程差異,如大鼠吸收碘非常快,而兔和豚鼠則吸收得慢,因而碘在二者的藥效也就有差異。②排泄過程的差異,如大鼠體內的巴比妥在3天內可排出90%以上,而雞在7天內僅排出33%,因此巴比妥對雞的毒性比對大鼠要大得多。氯黴素在大鼠體內主要隨膽汁排泄,存在肝腸循環現象,半衰期較短,藥物作用時間的長短就有差異。③代謝過程差異,如磺胺藥和異煙肼在犬體內不能乙酰化,多以原型從尿排出;在兔和豚鼠體內能夠乙酰化,多以乙酰化形式隨尿排出;而在人體內部分乙酰化,大部分是與葡萄糖醛酸結合,隨尿排出。乙酰化後不但失去了藥理活性,而且不良反應也增加。可見這2種藥物對不同種屬動物的藥效和毒性都有差別。
不同種屬動物對藥物的反應也有差異,大鼠、小鼠、豚鼠和家兔對催吐藥不產生嘔吐反應,在貓、犬和人則容易產生嘔吐。組胺使豚鼠支氣管痙攣窒息而死亡,對於家兔則是收縮血管和使右心室功能衰竭而死亡。苯可使家兔白細胞減少及造血器官發育不全,而對犬卻引起白細胞增多及脾髒和淋巴結增生;苯胺及其衍生物對犬、貓、豚鼠能引起與人相似的病理變化,產生變性血紅蛋白,但在家兔身上則不易產生變性血紅蛋白,在小鼠身上則完全不產生。
不同種屬動物的基礎代謝率相差很大。常用的實驗動物中以小鼠的基礎代謝最高,鴿、豚鼠、大鼠次之,豬、牛最低。
實驗動物由於遺傳變異和自然選擇作用,即使同一種屬動物,也有不同品係,經過采用不同遺傳育種方法,可使不同個體之間在基因型上千差萬別,表現型上同樣參差不齊。因此,同一種屬不同種係動物,對同一刺激的反應有很大差異。不同品係的小鼠對同一刺激具有不同反應,而且各個品係均有其獨特的品係特征。
近交係動物由於其基因型、表現型相同,故對刺激的反應性一致,實驗結果的重複性、可比性極好;而封閉群動物由於遺傳組成具有很高的雜合性,個體間反應性具有差異,故個體間重複性和一致性沒有近交係動物好。如在致瘤性實驗中,KM小鼠的腫瘤體積大小和重量個體差異較大,而BALB/c小鼠個體間差異較小。近交係動物由於高度近交而降低其在某些生理過程中的穩定性,使其對外界因素的敏感性比封閉群高,故對營養與飼養條件要求較高。
動物的解剖生理特征和反應性隨年齡而有明顯的變化,一般情況幼年動物較成年敏感。老年動物代謝能力低下,反應不靈敏,一般的動物實驗應選成年動物進行。慢性實驗或觀察動物的生長發育,應選擇幼齡動物。在老年醫學研究中,應選用老齡動物。題目設計要保證在動物生存期內完成。不同年齡尤其年齡差距較大的動物,對藥物的毒性反應亦有差異。如用斷奶鼠或仔鼠做實驗,其敏感性通常較成年鼠高。有學者將大鼠、小鼠分成幼年、成年和老年3組,分別觀察各組動物對乙醇、汽油、苯和二氯乙烷的急性毒性反應,並以LD50和麻醉濃度作為評判敏感性的指標,發現其敏感性從大到小順序為幼年>老年>成年。
三、生物因素對動物實驗的影響
生物因素涉及同種動物因素和異種生物因素等。同種動物因素包括社會地位,勢力範圍和飼養密度等。異種生物因素主要指微生物、寄生蟲及人等因素。
1.同種動物因素實驗動物也存在為社會地位和勢力範圍的相互爭鬥,在社會地位形成過程中可能發生激烈的爭鬥。這種現象在同一籠內飼養數隻雄鼠時經常能看到。沙鼠、倉鼠在配種時常有一隻被咬死。動物的爭鬥和社會地位也可影響到內分泌係統的功能。
實驗動物要有一定的活動麵積和空間。密度大使動物活動受到限製,同時由於排泄物大量增加,使溫度、濕度、有害氣體的濃度增加,患傳染病的機會增大,內分泌和代謝也隨之發生變化,對實驗結果造成影響,因此實驗動物飼養要有合理的密度。
2.異種生物因素異種動物之間可產生相互影響,將小鼠和貓在同一房間內飼養時,就會出現小鼠性周期不規則的現象。動物種間常有共患傳染病。健康的豚鼠如放入有隱性感染支氣管敗血杆菌的兔房中,豚鼠就會發病。因此不同種、品係的動物應分室飼養。
3.病原微生物對實驗動物的影響特別是動物潛在性感染往往無臨床體征和症狀,一旦外界條件適當或機體免疫功能低下時,疾病便可表現出來。在進行動物實驗時容易激活一些潛在的病原體引起發病,影響實驗結果。因此一定要選用清潔級,最好是SPF級的動物進行實驗。不宜采用不健康或患病的實驗動物,否則就會影響實驗結果。為確保實驗動物健康,動物購入後應有一定的檢疫觀察期,確認為健康動物後再進行實驗。對於大動物實驗前通常要觀察7~14天,除一般表現如攝食量、活動度及大小便外,應每隔1~2天稱體重、量體溫一次,發現不健康動物應予以剔除。
動物潛在性感染對實驗結果的影響也很大,如觀察肝功能在實驗前後變化時,必須要排除實驗用的家兔是否患有球蟲病,不然家兔的肝髒上已有很多球蟲囊,肝功能必然發生變化,所測結果波動很大。
四、實驗技術環節因素對動物實驗的影響
動物是由人飼養管理和進行實驗的,飼養管理和科研人員的素質直接影響動物實驗結果。要愛護動物、善待動物,要合理設計實驗,嚴格按標準實驗操作程序去做工作,才能得到準確的實驗結果。
1.動物實驗要求按照實驗室操作規範(GLP)和標準操作程序(SOP)嚴格執行這些法規對實驗動物、實驗室條件、工作人員素質、技術水平和操作方法都有明確要求。科研人員必須接受實驗動物學的培訓,持證上崗。
2.精神、神經因素對實驗研究的影響當動物遭受到虐待、創傷時疼痛、粗暴對待等意外刺激時,其內分泌係統、循環係統、免疫功能和機體代謝都與正常時不同。應養成日常善待動物,並熟練掌握捉拿、固定、注射、給藥、手術等技能,減少對動物的不良刺激。
3.給藥途徑這也是影響實驗的重要因素。如有的藥品可在胃內被破壞或在肝內分解,經口服給藥就會影響其效果。有些中藥製劑經靜脈注射和口服其療效相差很大。有些藥的效果與給藥次數和濃度關係很大,動物和人用藥劑量的換算也應準確。
4.保定和麻醉動物實驗中需要使用保定和麻醉,不同動物品種(係)對不同麻醉劑、麻醉方法的反應有所不同,必須根據實驗要求結合動物種類加以選擇。麻醉的深度控製與始終如一是順利完成實驗,獲得正確實驗結果的保證。如麻醉過深,動物處於深度抑製,甚至瀕死狀態,動物各種正常的反映受到抑製;麻醉過淺,在動物身上進行手術或實驗,將會引起強烈的疼痛刺激,使動物全身,特別是呼吸、循環功能發生改變,消化功能也會發生改變,從而給實驗帶來難以分析的誤差。要特別注意懷孕動物、新生動物和有攻擊性動物的保定和麻醉,以防止動物和人在操作時發生意外。
5.營養因素動物實驗後對動物的管理也非常重要,特別應保證動物有足夠量的營養供給。營養缺乏或過多都會影響實驗結果。
6.實驗季節和時間的選擇很多動物的體溫、血糖、基礎代謝率、各種內分泌激素的水平等許多功能都有年、月、日節律性的變化。動物實驗應注意動物的這些節律性變化,應選擇在同樣季節,每日在同樣的時間進行操作才能得到正確的實驗結果。
不同實驗季節,動物機體反應性有一定改變。如犬在春夏輻射照射後死亡率比秋冬為高;家兔的放射敏感性也在春夏兩季升高,秋冬兩季降低,而大鼠沒有明顯的季節性變化。機體的有些功能還有晝夜的規律性變動。如在對大小鼠的照射實驗中發現,白天放射敏感性降低,夜間升高,同時還發現,除夜間(21~24時)的高峰外,還發現白天(小鼠9~12時,大鼠15時)放射損傷加重。
7.對照問題在動物實驗中對照問題也非常重要,一般對照的原則是“齊同對比”。對照的方法很多,有空白對照、實驗對照、有效(標準)對照、配對對照、組間對照、曆史對照以及正常值對照等。對照要考慮到各種因素,如曆史對照與正常值對照,要十分慎重,必須要條件、背景、指標技術方法相同才可進行對比。否則將會得出不恰當的,甚至錯誤的結論。
有些實驗應當重複做幾種動物。肯定一個實驗結果最好采用2種以上的動物進行比較觀察,尤其是動物實驗結果要外推到人的實驗,所選用的動物品種應不少於3種,而且其中之一不應是齧齒類動物。常用的生物序列是小鼠→大鼠→犬→猴。
五、實驗誤差對實驗結果的影響
動物的實驗誤差主要由以下幾個方麵引起:①動物實驗人員、實驗動物工作人員進行實驗研究和實驗操作不熟練,缺少敬業精神,實驗動物飼養和管理人員沒有經過專門培訓;②動物實驗設施和環境控製不符合標準;③實驗動物質量不合格或背景資料不準確,動物選擇缺少科學依據;④實驗動物飼料不合格或營養成分、汙染物質不清楚、不穩定;⑤動物實驗設計不科學,不符合統計學原理,統計處理不準確;⑥實驗觀察不細、不準確;實驗記錄不全,原始記錄缺失;⑦ 實驗儀器不準,沒有定期校定,缺少必要的先進儀器;⑧動物實驗全過程缺少質量監督。
因此,在進行動物實驗時應可能減少實驗誤差,保證實驗結果的準確性和科學性。