第16章 實驗動物的選擇與應用(二)(2 / 3)

(2)卵的運輸當卵泡破裂時,有一部分卵泡液隨之流出,卵被排到圍卵巢腔內,所以不會發生漏到腹腔內的現象。當動情期時,圍卵腔變大並產生一種液體,能把卵帶到輸卵管傘部,加之漏鬥部的絨毛活動和輸卵管的收縮幫助卵運輸到輸卵管下段。卵子的大小並不取決於動物的個體,而幾乎完全取決於所積累的卵黃含量的多少。卵由卵巢濾泡運輸到子宮腔的時間為3~4天,不同實驗動物輸卵管內卵的運輸情況和受精時間不同。

4.常用實驗動物的生殖結構特點

(1)子宮結構特點家兔的子宮屬於雙子宮型,是由一對幾乎獨立的、遊離的子宮彎曲而成,2個子宮各有一個子宮頸分別與同一個陰道相通,即2個子宮的子宮頸共同開口於同一個陰道。齧齒類動物的子宮均屬雙子宮型。其中,大鼠的子宮呈Y字形排列,左左2個子宮頸開口於共同陰道,和家兔的子宮一樣,屬於雙子宮,雙子宮頸,單陰道類型。豚鼠的子宮屬於雙角型子宮,子宮頸有2個內口,但隻有一個公共外口。肉食動物的子宮屬於雙角型子宮,具有發育良好的2個子宮角,單子宮體,單子宮頸和單陰道,不過左右2個子宮腔愈合範圍較大,未愈合部分則形成弓狀彎曲的子宮角。犬的子宮角細而長,子宮體很短。另外,犬的子宮角腔內徑均勻,沒有彎曲,近乎直線,子宮頸很短,含有厚的肌肉層。靈長類動物的子宮屬於單子宮型、梨狀,無子宮角,輸卵管直接開口於子宮腔。

(2)胎盤類型牛、馬、豬為上皮絨膜型;綿羊、山羊為結締絨膜型;犬、貓為內皮絨膜型;兔為血內皮型;大鼠、豚鼠、恒河猴為血絨膜型。

犬缺少精囊和尿道球道腺,貓也沒有精囊,雄兔還有前列旁腺,鼠類多一種凝固腺,大鼠和小鼠有包皮腺。

(二)動物的選擇與應用

1.口服避孕藥物的篩選研究目前國內外廣泛應用的口服避孕藥(孕激素與雌激素的複合片以及單純孕激素藥片)其避孕效果都非常好,但還存在一定副作用。為了提高口服避孕藥的可接受率,有必要尋找更加理想、有效、安全、經濟、方便的藥物。篩選口服避孕藥的實驗動物多使用齧齒類實驗動物,因為它們具有規律的動情周期,排卵有明顯的指標,易於檢測,價格便宜,而具有月經周期的靈長類動物反而不是被選擇的對象。因為這類動物來源困難,價格昂貴,排卵和月經周期難於檢測。當動物實驗證實某藥物有抗生育的效果後,還必須進行各種藥理實驗。

2.避孕藥物的藥理研究

(1)女用避孕藥物研究最基本方法是抗生育實驗,就是在與雄性動物合籠前和合籠交配期間,給雌性動物服藥,觀察藥物對生育的影響,以檢查雌性動物懷孕百分率和每隻孕鼠之胚胎數為指標。如果能找到一種藥具有防止受精卵著床或中斷早期妊娠的作用,那就不必天天服藥,而隻在需要時服用,這是避孕藥研究工作者多年來的一項設想。

做抗著床和抗早孕實驗:抗著床實驗是將雌鼠與雄鼠合籠,每天上午檢查雌鼠陰道口有無陰道栓,於出現陰道栓後第1~5天,每日給藥一次,於陰道栓出現後第12天處死動物,以胚胎數和懷孕百分率為指標。某些齧齒類動物在交配後,隨即形成的一種白色漿液性物質,堵塞在陰道至子宮頸的腔內,稱為陰道栓(vaginal plug)。它是檢查動物是否交配的一種標誌,將出現陰道栓的當天算為妊娠“零天”。陰道栓是由雄鼠精囊腺和凝固腺的分泌物在陰道內凝固而成的產物。小鼠一般在交配後4~5min內形成。大的陰道栓可凸出於陰道口,小的陰道栓或在子宮頸內,需要翻開陰道口才能查見。陰道栓一般在交配後1h起漸漸軟化,經16~24h後脫落。但也有隻存在4~5h,而最多的可存在48h以上。小鼠陰道栓比較牢固,大鼠的陰道栓不牢固,容易脫落,所以檢查大鼠陰道栓時,除檢查陰道外,還應在籠底尋找陰道栓。亦可用生理鹽水衝洗陰道,在顯微鏡下檢查衝洗液中有無精子,有精子表示已交配。抗早孕實驗是在著床(出現陰道栓後第5天著床)以後給藥,一般於陰道栓出現後第6~9天連續給藥4天,第12天處理,以檢查胚胎數和死胎為指標。抗生育、抗著床和抗早孕實驗中最常用的動物為壯年的28~35g的小鼠,也可用體重200~250g的大鼠。在探討一個避孕藥的作用原理時,有時需要檢查一個藥物有沒有抑製排卵作用。需要進行抗排卵實驗,常選用體重2~3.5kg的雌兔進行實驗。

(2)男用避孕藥物研究長期以來,對男用避孕藥的研究不很重現,進展緩慢。藥物通過抑製精子的生成過程,幹擾男性生殖活動的激素調節,幹擾副性腺和改變精液的理化特性等,均可達到不孕的目的。現在認為,精子形態的成熟是在睾丸,而生理的成熟是在附睾。藥物作用於副性腺,幹擾精子成熟或改變精液理化性質所引起的男性不育似較理想。常選用成年雄性大鼠做實驗,如觀察藥物對大鼠生育力的影響;對大鼠精子數的影響;對大鼠精子活動力的影響以及對雄性激素的作用等。

實驗中常需要采集實驗動物的精液,采集的方法有電刺激法、假陰道法、按摩法以及直接殺取法。

陰道塗片可以準確地判斷大鼠和小鼠動情周期的各個階段,從而可推測排卵前LH峰及排卵,但此方法很少用於田鼠,因為田鼠在動情周期陰道有滲出物,所以不一定要做陰道塗片。推測靈長類動物LH峰,須測定外周血的孕激素水平,如單獨根據月經出血期來推測有可能導致判斷的錯誤。

十、微循環研究中實驗動物的選擇與應用

通常用以進行微循環研究的動物有:小鼠、大鼠、金黃地鼠、家兔、貓、犬,最近也有用羊、小牛或猴的。研究微循環的方法很多,有間接法(如86Rb測心肌營養性血流量)和顯微直接觀察法之分。後者一般又分兩大類:一類是體表微循環實驗方法;另一類是內髒微循環實驗方法。體表微循環動物實驗方法有金黃地鼠頰囊循環,家兔眼球結膜和眼瞼微循環,家兔舌尖微循環,蝌蚪尾部微循環,還有兔耳、兔耳透明窗和大鼠氣管微循環等。內髒微循環的實驗研究方法也很多,有用動物的腸係膜、心肌和肝髒等來觀察研究其微循環,其中觀察腸係膜的方法種類較多,可用大鼠、家兔、豚鼠、小鼠等的腸係膜。也有利用髒器“開窗”手術做慢性實驗,還有取用觀察部位的活組織通過電子顯微鏡觀察並做超微結構攝影。當前物理化學的研究方法——血液流變學也不斷被采用,例如,紅細胞電泳、血黏度的測定、測定微血管的壓力、血小板和紅細胞凝集功能的測定、血小板黏附性的測定等方麵的研究以及觀察毛細血管通透性的變化等。

可進行微循環觀察的動物器官如下。

1.頭部器官動物的眼球結膜、虹膜、眼底、鼻黏膜、口唇、牙齦、舌、鼓膜、耳殼等都可以用普通顯微鏡在放大40~100倍的條件下進行微循環觀察。這些部位的動物觀察方法與人的相似。以家兔眼球結膜觀察方法為例:要選用白色家兔,因其眼球結膜無色,微血管清晰可見。不可采用灰色或黑色的家兔,因其眼球結膜色深,不易辨別其微血管。

2.氣管正常大鼠或家兔氣管軟骨環間區的微血管較為豐富。細靜脈、細動脈血流方向相反,毛細血管網穿插於細動脈和細靜脈間,而在軟骨環表麵上有極細的毛細管網。微血管內血流均勻,流速較快,血管充盈度良好。連續觀察25~30min不見有明顯改變。氣管炎模型的大鼠氣管微循環出現明顯變化,變化程度與氣管黏膜病變程度密切相關。活血化淤藥物注入後,可明顯改善大鼠氣管炎微循環障礙。

3.肺一般用家兔、貓、犬或其他大動物進行。要謹防損傷胸膜,隻要在胸膜上造成針尖大小的孔,肺便可發生萎陷。

4.頰囊在金黃地鼠動物口腔兩側後角各有一頰囊供儲存食物之用。頰囊組織與皮膚組織相似。頰囊的伸縮性很大,其容量可由1~2ml擴張到5~6ml。頰囊血供豐富,有致密的微血管網,是各種口徑的微血管高度集中之地。頰囊組織薄而嫩,顏色淡,透光性好,微血管清晰,製備簡單,既可做急性實驗,也可做慢性連續觀察實驗,而且由於它是雙側對稱器官,有些實驗過程可在同一動物身上進行自身對照。

5.腸係膜、大網膜、腸壁小鼠、大鼠、豚鼠、田鼠、家兔、貓、犬等動物的腸係膜和大網膜及腸壁皆可用於微循環觀察,並且無明顯差別,所用動物不宜過老,否則脂肪過多影響觀察。回盲部腸係膜是最好的微循環觀察區。因為它具有區域小而局限、沒有腸蠕動、取出時不易損傷、脂肪組織少等優點。在進行腸係膜微循環觀察時,要特別注意維持動物體溫恒定。因為過冷或過熱都要引起不正常的腸蠕動,影響實驗效果。

十一、皮膚病學研究中實驗動物的選擇與應用

1.麻風病研究裸鼠對麻風杆菌具有高度易感性,1975年發現麻風杆菌接種於裸鼠足墊後能大量繁殖,並擴散至全身,引起瘤型麻風。以往麻風杆菌隻有在背上長夠9條紋的犰狳身上才能生長,而這種產於南美等地的動物難於尋找,也不易飼養和操作。現在可以在裸鼠身上接種麻風杆菌,並且生長良好,病理組織學檢查結果類似人的瘤型麻風感染,這為研究麻風杆菌生理學特性、免疫原性和麻風病發病機製提供了極為有用的實驗模型。裸鼠的感染能傳代,有再現性,在裸鼠的足墊內接種麻風杆菌,並分別一次給0.5mg和每2周0.2mg利福平,結果類似於人一次服利福平1500mg或者每天給600mg共2周那樣的效果。從每天用利福平治療的病人那裏取來麻風杆菌接種裸鼠,結果表明僅在服用利福平450mg,2天以後細菌即喪失其感染力。異煙肼、二甲胺四環素、氯潔黴素對裸鼠體內麻風杆菌無致死作用。氨苯碸對裸鼠中生長的麻風杆菌起抑製作用或抑菌作用。這些結果提示,裸鼠作為麻風化療研究的模型有著重大的價值。常選用CFW小鼠建立鼠麻風足墊感染模型。過去在篩選抗麻風藥物、驗證耐藥菌株、判斷細菌活力、開展實驗化療等方麵常被應用。在正常小鼠足墊中的麻風杆菌繁殖有限,到一定數量後即不再增加,這和正常小鼠在足墊感染後期出現對麻風杆菌的細胞免疫有關。如用胸腺摘除並經X射線照射的免疫抑製鼠進行足墊接種,麻風杆菌在足墊中的對數生長期延長到接種後13個月,且菌量比正常小鼠明顯增高,可達100~1000倍,以後感染可散播到耳、尾、鼻、前後足等部位。病理組呈現偏瘤型麻風的特點。不過免疫抑製鼠死亡率高,難以進行長期的研究,不夠理想。

2.黑色素瘤研究裸鼠是人類惡性黑色素瘤適宜的動物模型,有利於人類惡性黑色素瘤的研究和治療。黑色素瘤移植到裸鼠的成功率比較大,為50%~70%。用同樣藥物化學治療,其結果與臨床醫治病人的實踐相類似。這可為人類黑色素瘤的治療方法提出許多有效的藥物和藥物聯合體,也為黑色素瘤的檢測和免疫治療提供了新的方法。裸鼠還可用於其他皮膚腫瘤(如基底細胞和扁平細胞癌等)的誘發、生物學特性及治療研究。

3.真菌感染研究裸鼠用於真菌感染實驗相當合適,特別是對新型隱球菌高度易感。裸鼠作為宿主對抗真菌感染時的防禦機製研究是很有用的。近年來,利用CFW幼鼠可建立真菌感染模型,尤其是應用於念珠菌病的診斷和治療方法的研究,對隱性患者的早期診斷更有意義。

4.免疫血清學研究隨著免疫血清學研究的需要,目前已發展成用致敏動物含反應素抗體的血清注射到同種或密切相關的異種正常動物皮內,24~72h後,靜脈注射抗原,觀察局部皮膚過敏反應,統稱PCA反應。藥物對各種動物PCA反應的影響是不同的。抗組胺藥對各種動物PCA反應均有抑製作用,說明各種動物PCA反應時,均有組胺釋放。但色甘酸二鈉可抑製大鼠PCA反應,而對小鼠及兔PCA反應則無影響,因此,應用PCA反應來判斷一個藥物的抗變態反應作用時,最好不要根據一種動物PCA反應的結果。PCA反應試驗常選用的動物是大鼠,亦用小鼠,有時根據實驗需要用兔。這些動物PCA(24~72h)反應是由IgE介導的。豚鼠很少采用,因其PCA反應主要是由IgG介導的。

5.腫瘤研究辛克萊豬(Sinclair)能自發惡性黑色素瘤,並且與人類的相應腫瘤有許多共同的特點:腫瘤是自發性的;有由良性黑色素細胞病變轉變為惡性能力;豬的黑色素瘤組織學上類似人的淺表擴散性黑色素瘤;轉移發生於深部浸潤皮膚腫瘤;轉移表現與人類黑色素瘤轉移的分布相似;宿主體內發生腫瘤相關性免疫反應;遺傳成分十分明顯,與人類某些黑色素瘤的遺傳成分相當。但有些特點可區分豬與人的黑色素瘤,如白豬不發生黑色素瘤;豬腫瘤發生與紫外線照射無關;大多數病豬的腫瘤能完全消退。豬黑色素瘤模型與人類惡性黑色素瘤有許多共同的特點,而且有可靠的證據說明宿主免疫因素對這一腫瘤的發生、生長及消退都有作用。

6.皮膚病研究家犬可以自發全身性紅斑狼瘡;豚鼠是研究實驗性接觸性變態反應的常用實驗動物,並為研究接觸性變態反應的最佳動物。豚鼠易於致敏,其發生的變態反應性接觸性皮炎(ACD)與人類十分相似。然而豚鼠軀幹部表皮層較薄(僅4層細胞),發生的病理變化與人類也有差異,如不易發生水皰等。而乳暈部表皮較厚,層次基本與人類表皮相當,且無毛,便於標本製作和觀察。

十二、病毒學研究中實驗動物的選擇與應用

病毒學研究常選用的實驗動物有金黃地鼠、小鼠、豚鼠、家兔、綿羊、禽類、猴等。分離病毒廣泛使用的是乳鼠,它對柯薩奇病毒、呼吸道腸道病毒和蟲媒病毒感染有高度易感性。許多柯薩奇病毒A型直到目前仍然不能在1個月齡小鼠以外的任何非人的宿主中培養。因此,目前研究蟲媒病毒常選用小鼠乳鼠及剛斷乳的幼鼠,A型柯薩奇病毒需用出生1天內的小鼠培養。用感染乳鼠腦製備補體結合抗原,滴度常較高且非特異性反應較少。其他實驗動物,如成年小鼠、兔、豚鼠、雪貂在人類病毒學的發展史上曾起過關鍵性作用,但目前它們主要用來研究病理機製、製備診斷用品等,並不用於分離病毒。靈長類動物廣泛用於致病性研究,特別是可能由“慢病毒”感染引起的一些疾病。選用作為病毒學研究的實驗動物,應首先考慮采用該病毒的易感動物。

在進行腫瘤病毒研究時要注意選擇病毒的自然宿主和實驗宿主動物。因為病毒與腫瘤關係主要來源於實驗動物的研究,實驗動物的選擇很重要。動物腫瘤病毒因所含核酸不同而分為2類,即RNA腫瘤病毒和DNA腫瘤病毒。RNA腫瘤病毒有3種電鏡形態,稱為A型、B型和C型。最常見的為C型顆粒。DNA病毒中,有多種能引起動物腫瘤。其大小不一,最大的病毒如痘病毒、皰疹病毒、傳染性軟疣病毒,最小的病毒如多瘤病毒。

病毒敏感動物的研究,一直是病毒學中的重要內容之一。實驗動物在人類病毒學發展史上曾起過重要作用,主要用做分離病毒、研究發病機製、抗病毒藥物篩選、疫苗效果及完全性鑒定、製備診斷用品等。實驗動物選擇,應注意影響動物實驗效果的各種因素。

不同種屬動物對同一致病因素的易感性不同,對一種動物是病原體,對另一種動物可能並不致病。即使是同一種屬動物的不同品係,對同一刺激的反應也有很大差異。年齡、體重、性別、生理狀態、健康情況,往往導致對同一刺激的不同結果。此外,病毒學研究中,接種途徑的改變往往導致不同的感染結果。實驗中,應盡量利用經微生物控製的動物和純係動物。

常見病毒敏感動物的選擇如下。

1.黃熱病毒靈長類動物都易感,最為敏感的動物是恒河猴,另外,可用中國猴(Macacus Sinicus)及短尾猴(M。Speciosus Thibetanus)。小鼠對黃熱病毒也敏感,在沒有經濟實力使用靈長類動物時,可用小鼠。令人感興趣的是:純血清接種的小鼠尚能存活,而以稀釋血清接種的小鼠卻於較短時間死亡。這一奇特現象的理由,可能是由於病人體內血清抗體早期出現之故。應用純血清時,這些抗體中和了病毒的作用,而當應用稀釋血清時,抗體濃度不足,但病毒在稀釋後仍然具有活力。

2.乙腦病毒乙腦病毒屬於披蓋病毒的B組蟲媒病毒。實驗室內,乳鼠和成年小鼠腦內接種後發生致死性腦炎,腹腔內接種後乳鼠發生致死性腦炎。恒河猴、食蟹猴和成年倉鼠腦內接種後發生致死性腦炎,但周圍途徑接種時隻發生無症狀的病毒血症。豚鼠和兔腦內或周圍接種,蝙蝠和小雞周圍接種後都隻發生無症狀的病毒血症。蝙蝠可保持感染,經過冬眠後重新發生病毒血症。

3.淋巴細胞脈絡叢腦膜炎病毒(LCMV)本病毒屬沙粒病毒屬,對小鼠腦內接種尤為敏感,可供分離病毒用,對猴及豚鼠有致病力。應使用4周齡的小鼠及乳鼠、未斷乳豚鼠和200~400g重的豚鼠。可能時,采用瑞士Albinos種小鼠。飼養中,應確保無LCMV病毒感染。為取得最好效果,一方麵接種幼年動物,另一方麵用年齡較長的動物。

不同接種途徑的感受性亦不同。腦內接種感染而發病的鼠數(4周齡以上的)遠比經腹腔內接種者為多。經腹腔接種者可不顯任何症狀。豚鼠(250g以上)2種接種途徑的發病數大致相等(有時腦內接種稍高些),但這些資料並不對所有毒株適用。小鼠感染後表現多樣,可能有3種情況:①急性疾病並死亡;②急性疾病,恢複並產生抗體;③形成持續感染,攜帶病毒,不產生抗體。產生急性疾病的動物一般在感染後4~7天出現體征,表現為弓背、豎毛、嗜睡、眼炎、頭部水腫等。

4.脊髓灰質炎病毒屬小核糖核酸(RNA)病毒科、腸道病毒屬的一種。1908年Landsteiner和Popper成功地把此病毒傳播於猴。在後來的40年裏證明了亞人類靈長類動物能經消化道感染。

(1)猴在此屬內猩猩能感染和人類完全相似的疾病,但此類動物不易常備。實際工作中,各種不同的獼猴對本病來說是猿類中最為優良的品種,特別是Macacus Rhesus。長尾猴類以及狒狒類對脊髓灰質炎病毒亦有感受性,唯敏感性遠較獼猴為差。接種方法可用腹腔注射、坐骨神經附近的深部肌內注射、鼻腔滴注。實際操作中最好以不同方法混合接種。

(2)齧齒動物病毒在應用於齧齒動物前,常需經猿類適應1~2代。齧齒動物(棉鼠、小鼠、田鼠、鼷鼠)可經腦內接種,最好選用年幼的動物、2~3周齡的小鼠或15天齡的棉鼠。動物常於12~25天出現麻痹。

5.柯薩奇(Coxsackie)病毒屬小RNA病毒科腸道病毒屬。根據本病毒對乳鼠的致病情況將其分成2組。A組:產生彌漫性肌炎伴有隨意肌纖維的急性炎症及壞死。B組:主要引起大腦局部退行性變化等。