(1)控製和降低酵母的增殖級數α-乙酰乳酸是酵母繁殖細胞、有氧代謝的伴隨產物。酵母隻能合成α-乙酰乳酸,不能直接催化α-乙酰乳酸而形成雙乙酰,但是雙乙酰能被酵母還原。
選擇產生雙乙酰峰值低的菌種、適當提高酵母添加量、較低的接種溫度、避免強烈通風、滿罐時間最好小於12h、抑製酵母的增殖濃度(即增殖級數小於3)、確保酵母活力強壯,能有效降低α-乙酰乳酸的產生量,降低雙乙酰峰值,有利於快速還原雙乙酰。
(2)適當提高麥汁中α-氨基氮含量(實質是提高纈氨酸含量)纈氨酸能通過反饋抑製α-乙酰乳酸的生成,從而抑製了雙乙酰的形成。
國外有在麥汁中添加富含纈氨酸的氨基酸製品來抑製雙乙酰形成,添加量6~8mg/L。
(3)提高雙乙酰還原溫度,加快雙乙酰還原酵母中的還原酶對雙乙酰的還原速度是溫度的函數,提高還原溫度是促進雙乙酰迅速降低的有效措施。溫度高,還原速度快,所需雙乙酰還原時間短。
(4)發酵罐罐壓控製雙乙酰還原期間,發酵液中的雙乙酰必須進入酵母細胞中,才能被酵母細胞中的還原酶還原。控製較高的發酵罐罐壓,有利於發酵液中的雙乙酰滲透進入酵母細胞膜內,加快雙乙酰的還原(高溫、高壓可加快還原)。應注意在形成罐壓時,如果導致酵母過多、過早沉降,反而不利於雙乙酰還原。
(5)發酵菌株選擇選擇產生雙乙酰峰值低、還原雙乙酰能力強、有一定凝聚性的啤酒菌株,確保還原雙乙酰期間酵母強壯、懸浮酵母數多,有利於雙乙酰還原。良好的發酵過程控製,高質量的麥汁,能避免酵母沉降過早,有利於雙乙酰還原和徹底發酵,前發酵結束,下酒到後發酵時,添加10%~15%的高泡酒,利用高泡酒中懸浮的多量酵母,來加快雙乙酰的還原。
(6)CO2的洗滌利用CO2的洗滌工藝,隨著CO2的揮發而帶走發酵液中揮發性的雙乙酰(雙乙酰能聞到,說明具有揮發性)。同時,還可排出乙醛、硫化物等。洗滌時間一般1~2h,排除的CO2可回收。
(7)添加α-乙酰乳酸脫羧酶(酶製劑)發酵時,添加α-乙酰乳酸脫羧酶(俗稱雙乙酰還原酶),直接將α-乙酰乳酸還原成丁二醇。
添加量:丹麥NOVO公司生產的酶製劑,0.5~1L/100m3發酵液。
(8)發酵結束後,如果在濾酒及罐裝中重新接觸O2、巴氏殺菌溫度高,發酵液中沒有轉化的α-乙酰乳酸又會被氧化成雙乙酰,表現為清酒或成品酒中雙乙酰含量超過發酵液中雙乙酰的含量,稱為雙乙酰回升。為防止這一現象,發酵時應盡可能徹底還原雙乙酰(控製總雙乙酰),盡可能減少啤酒吸氧,也可在清酒罐中添加α-乙酰乳酸脫羧酶,一般添加0.15~0.20L/100m3清酒,可大大降低雙乙酰的回升幅度。
(9)良好的無菌發酵環境,可避免通過啤酒有害菌的汙染,有利於雙乙酰的控製一般來說啤酒酵母形成雙乙酰與2,3-戊二酮的比例為(2~3)∶1,而四鏈球菌等啤酒有害菌僅形成雙乙酰。所以,當出現嚴重的啤酒有害菌的汙染,那麼雙乙酰與2,3-戊二酮的比例會發生變化,而且會出現雙乙酰回升的現象。
(10)生物技術丹麥、芬蘭、美國等國家,利用基因改良工程培育新的酵母菌種,選育出不產生或少產生雙乙酰的酵母菌株,並將α-乙酰乳酸脫羧酶克隆到啤酒酵母中。
(五)硫化物的形成
硫化物是酵母代謝中不可缺少的成分,一般含量較少,過多會給啤酒帶來硫臭味,影響啤酒風味。
1.啤酒中硫化物的來源
2.硫化物的種類、作用
啤酒中存在多種含硫化合物,分為兩類:非揮發性,占94%,主要是硫酸鹽、甲硫氨酸;揮發性,占6%,主要是SO2、H2S、DMS、甲基(乙基)硫醇。
非揮發性硫化物對啤酒風味影響較小,但它們都是酵母發酵代謝產生揮發性硫化物的來源。硫化物對啤酒質量的影響具有雙重性:微量存在,隨著硫化物揮發,對啤酒有增香作用;含量過多,帶來硫臭味——酵母臭(酵母自溶,酵母體內的硫進入啤酒)。
H2S閾值:<10μg/L(>10μg/L洋蔥味,>50μg/L臭蛋味);
DMS閾值:<50μg/L(>50μg/L腐爛的青草味)。
3.H2S的形成途徑和影響因素
(1)H2S的形成途徑
①酵母對半胱氨酸的代謝:因麥汁中半胱氨酸含量較少,形成H2S較少。
②酵母對硫酸鹽的代謝:這是主要途徑。
③雜菌、野生酵母的汙染,代謝形成H2S。
(2)影響H2S形成的因素
①麥汁成分:麥汁中α-N含量高,半胱氨酸相應高,H2S形成多;麥汁中硫酸鹽多,H2S形成多;冷、熱凝固物分離徹底的麥汁,硫化物含量減少,發酵時可以減少H2S的形成。
②酵母:不同的菌種,形成H2S的量不同;酵母添加量多,形成H2S多;酵母衰老、退化,細胞膜半透性差,硫酸鹽容易進入,H2S形成多,酵母自溶分解產生的H2S多;酵母缺乏生長素時,也會導致啤酒中含有較多的H2S。
4.DMS的形成和影響因素
現代研究表明,隻有DMS的活性前驅體氧化為DMSO後,在發酵過程中可通過酵母將其中一部分的DMSO(1.7%~5.0%)還原,又產生遊離的DMS。其含量取決於酵母菌株、發酵條件及麥汁中的DMSO含量。啤酒酵母正常發酵時,並不形成DMS或者形成很少。啤酒中的DMS主要由麥芽、汙染細菌帶入,由於雜菌、野生酵母細胞中有較多的甲基轉移酶,所以汙染細菌後,會形成DMS。選擇焙焦強度適當的麥芽,要求成品麥芽中DMSP小於5~7mg/kg幹物質;采用煮出糖化法,煮沸時保持一定的蒸發率,麥汁冷卻前采取汽提方式排除DMS,可降低冷麥汁中的DMS含量;其次避免雜菌、野生酵母的汙染,減少雜菌汙染產生的DMS,就能基本控製啤酒中的DMS含量。
一般啤酒中DMS含量分為:上麵發酵啤酒(Ale啤酒)為4~14μg/L;下麵發酵啤酒(國內淺色啤酒)為27~37μg/L。
5.SO2
SO2是啤酒中內在的抗氧化劑,能延緩自由基的形成,與醛結合形成非口味性的加成產物,如反壬烯醛-亞硫酸鹽,有利於啤酒的口味穩定性。下麵發酵淺色啤酒含有0~10mg SO2/L,超過10mg/L,可作為防腐劑使用。二氧化硫的形成與酵母種類有關,上麵酵母一般不形成SO2,所以小麥啤酒中SO2含量低。麥汁濃度高、鋅含量高、硫酸鹽含量高、冷麥汁通風量適當低些,有利於二氧化硫形成。
(六)酸類物質的形成
1.酸與啤酒
啤酒中的酸性物質有100多種。啤酒中的酸性物質由麥芽等原料帶入、糖化生化反應產生、酵母發酵代謝形成及外加酸(乳酸、磷酸等),有一句酒行業的俗語“無醇不是酒,無酸不成酒”。凡是酒都是帶酸性的(pH<7)。酸類物質雖然並不構成啤酒的香味,但它是主要的呈味物質,適量的酸能使啤酒協調、平衡、爽口,口感活潑。而過量酸的存在會使酒體顯得粗糙、不平衡,酒體刺激感強。
酸對啤酒的作用如下。
(1)凡是酸都具有酸性,構成啤酒的總酸。
(2)影響啤酒的風味,帶來酸味;增加酸氣味(揮發性酸的揮發);增加苦味(有些酸,酸而苦)。
(3)酮酸是許多代謝途徑的彙合點。
麥汁的總酸(滴定酸)一般在1.4~1.7mL(1mol/L NaOH);啤酒的總酸一般要求不大於2.6mL(1mol/L NaOH);啤酒發酵中可增加滴定酸為0.9~1.2mL(1mol/L NaOH)。
發酵中產酸量受到麥汁總酸量的負麵影響,麥汁總酸越高,發酵產酸量越少。麥汁中和啤酒發酵產生的酸,隻有70%~80%最後殘留於啤酒中,有些隨著Ca、Mg等鹽沉澱、消耗了。
有些啤酒總酸並不高,但在飲用時酸刺激感較強,其原因一般是啤酒中揮發性酸含量太高。若啤酒中揮發性酸含量(以乙酸計)超過100mg/L,就意味著啤酒已經酸敗。
2.脂肪酸
啤酒中含有C1~C18組成的直鏈脂肪酸,還有異丁酸、異戊酸等20餘種脂肪酸。根據碳鏈上碳個數的多少可分為短鏈、中鏈、長鏈的脂肪酸。通常短鏈脂肪酸的溶解性好、易揮發,對pH的影響大。數量最多的是乙酸(CH3COOH),正常含量為50~80mg/L。其他的脂肪酸含量順序為:C8、C6、C4、C10等。下麵發酵啤酒比上麵發酵啤酒脂肪酸含量高1/3。
隨著碳鏈上碳個數的增加,脂肪酸的溶解性下降,揮發性也降低,中鏈脂肪酸還呈一定的氣味。長鏈脂肪酸溶解性差,其中的不飽和脂肪酸會直接影響啤酒口味穩定性、泡沫性能。
(1)脂肪酸的形成途徑
①大麥中的脂肪在發芽、糖化時被酶分解,形成溶解性差的長鏈脂肪酸,伴隨固形物含量高的過濾麥汁,不徹底的熱凝固物的排除等,殘留在麥汁中比較多。
②酵母的自身合成與自溶:酵母在繁殖、生長過程中需合成達其幹重14%~17%的脂類物質,參與酵母細胞結構。合成產生的部分脂肪酸,與酰基輔酶A化合,又被酵母分泌到發酵液中。酵母自溶會使啤酒中的中鏈脂肪酸含量上升。
酵母細胞通過脂肪酸合成酶合成的脂肪酸+乙酰輔酶A偶數碳鏈的脂肪酸(C2、C4、C6、…、C18)
酵母細胞通過脂肪酸合成酶合成的脂肪酸+丙酰輔酶A奇數碳鏈的脂肪酸(C1、C3、C5、…、C17)
③醛與醇的氧化形成
④雜菌的汙染:麥汁、發酵液汙染了雜菌(醋酸杆菌、野生酵母、乳酸杆菌),會形成大量的醋酸。
(2)影響啤酒脂肪酸含量的因素脂肪酸一般在發酵前4d與相應的高級醇同時形成。
①原料:所含脂肪酸含量高,放置時間長,由原料帶入的脂肪酸多。
②過濾麥汁不清亮、固形物多,煮沸強度低,熱、冷凝固物分離不徹底,使冷麥汁中脂肪酸含量過高,最終進入到啤酒中的多,影響啤酒口味和口味穩定性。
③酵母:酵母合成乙酰輔酶A的能力強,啤酒脂肪酸含量高;酵母自溶後,會從細胞內溶解出大量的中鏈脂肪酸,對啤酒風味影響極大。
④發酵工藝:加大酵母添加量,增加麥汁通風量,提高發酵溫度,快速發酵,啤酒脂肪酸含量少。
啤酒中含有過多的脂肪酸,不利於泡沫性能、口味穩定性、啤酒口味純正。
另外,人們也開始關注麥芽中的揮發性酸含量,如果浸泡時洗麥徹底、滅菌效果好、發芽溫度較低、出爐水分低,則有利於降低麥芽中的揮發性酸。在麥汁煮沸、麥汁處理時,盡可能徹底除去來自原料中的揮發性酸,有利於降低啤酒中揮發性酸的數量。
3.有機酸
(1)有機酸的種類主要有檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸、乳酸、草酸、酮酸同類物(丙酮酸、酮戊二酸等)。
(2)有機酸的形成
①糖類的發酵,EMP途徑、三羧酸循環過程中的副產物。
②利用氮時形成的一些中間產物。
③雜菌(乳酸杆菌)的汙染,會形成較多的乳酸。
其中琥珀酸是有鹹味、苦澀味的酸,風味不太好。啤酒中的琥珀酸含量在50~150mg/L,閾值為65mg/L,優良的啤酒中琥珀酸含量在45~65mg/L。經檢測我國啤酒中琥珀酸含量在120~150mg/L,降低啤酒中的琥珀酸含量,對改善啤酒的風味很有意義。
四、發酵過程中的其他變化
除了糖的代謝及變化、含氮物質的轉化、代謝產物的形成和還原等變化之外,發酵過程中還發生對啤酒質量、啤酒口味、啤酒過濾影響大的變化,如色度的變化、pH的變化、苦味物質的變化、rH值的變化、CO2的溶解、草酸鈣的形成、酒液的澄清等。
1.色度的變化
色度由深變淺的過程主要發生在主發酵期間。色度下降的幅度隨麥汁色度深淺而變動,麥汁色度越深,降低幅度越大。一般淺色啤酒下降1.5~2.5EBC。色度降低的原因是:隨著發酵溫度、pH的變化,麥汁中的色素物質析出沉澱或進入泡蓋;通過酵母細胞壁或其他沉澱物的吸附作用,吸附色素物質減少。
2.pH的變化
麥汁的pH一般為5.2~5.6,啤酒的pH為4.1~4.4。pH下降變化的規律為前快後慢。pH下降的原因是發酵時形成脂肪酸和有機酸等酸性物質、產生了CO2酸性氣體、酵母消耗一級磷酸鹽、吸收鉀離子後釋放氫離子。
較低的發酵液pH有利於蛋白質和多酚物質的凝聚析出、色素物質的析出,有利於啤酒非生物穩定性、苦味質量、色度;低pH能抑製雜菌的生長,生物穩定性提高;低pH使還原雙乙酰速度、發酵速度加快,促進酵母凝聚、沉澱,有利於酒液澄清。
如果酵母添加量多,發酵溫度高,發酵速度快,緩衝能力低,則pH下降快、程度大。不利於啤酒泡持性和醇厚性。麥汁的緩衝能力會影響pH下降幅度,輔料比例高、添加氯化鈣多、啤酒的原麥汁濃度越低,導致緩衝能力低,成品啤酒的pH低。發酵時出現pH上升,說明酵母嚴重自溶,不利於啤酒質量。
3.苦味物質和多酚物質的變化
麥汁加酒花煮沸後,酒花中的α-酸等溶解、異構化,使麥汁具有一定的苦味值。發酵後未異構化的α-酸會析出,大約有1/3的苦味物質損失,苦味值降低。影響因素有如下幾個。
(1)麥汁通風量越多,苦味物質損失越多。
(2)隨著發酵溫度、pH的變化,麥汁中的苦味物質析出沉澱或進入泡蓋。
(3)在發酵過程中,苦味物質的損失與酵母添加量無關,而與酵母增殖量有關。增殖量越大,苦味物質損失越大。
(4)通過酵母細胞壁的吸附作用吸附沉澱。
多酚物質、蛋白質-多酚隨著pH下降、溫度下降而析出,有利於苦味質量、啤酒非生物穩定性,也伴隨啤酒的色度下降。
4.rH的變化
rH是表示溶液氧化-還原電勢的一種方法。麥汁、發酵液、啤酒中許多的氧化性和還原性物質互相作用,達到平衡時,反映在電極電位上的數值,稱為rH。
rH大,氧化性強,還原性弱;rH小,還原性強,氧化性弱。
麥汁的rH為20~26(麥汁通氧後,氧含量較多,rH較高);發酵液的rH為8~10(隨著酵母的繁殖,氧很快被酵母消耗,因而rH逐漸降低)。
rH的大小,影響酵母的生理活動,能改變酵母的發酵產物。在rH低時,乙醛通過乙醇脫氫酶的還原作用形成乙醇。
5.CO2的產生
有氧、厭氧發酵時形成的CO2是重要的反應產物,所以發酵過程也是產生CO2的過程,可將多餘的CO2回收。成品啤酒也需要一定的CO2,有利於啤酒的殺口力、氣泡性。啤酒中CO2含量一般為0.4%~0.6%(質量分數)。
6.草酸鈣的形成
草酸鈣在啤酒行業俗稱啤酒石,是一種黃色晶體狀物,會附著在發酵容器和管道的內表麵。草酸是一種有機酸,是糖類發酵(有氧呼吸)三羧酸循環過程中的中間產物,與發酵液中的鈣離子結合,形成草酸鈣沉澱。啤酒石可用酸洗除去,一般用0.5%的硝酸,這也是發酵設備需要定期酸洗的原因。