1.2.5RT-PCR檢測mRNA表達：將成纖維細胞以4× 105個接種在10cm培養皿中，經預設方法幹預24h後應用Trizol液裂解細胞，後經氯仿、異丙醇進一步提取細胞的總mRNA，調整RNA的上樣量為1mg/L，以β-actin為內參，進行RT-PCR。相關引物設計如下（表1）：CollagenⅠ上遊序列：5′-GTGAACCTGGCAAACAAGGT-3′，下遊序列：5′-CTTGGTCGGTGGGTGACTCTG-3；Smad7上遊序列：5′-TACCCGATGGATTTTCTCAA-3′，下遊序列：5′-TCTTCTCCTCCCAGTATGCC-3′；β-actin上遊序列：5′-CACCAACTGGGACGACA-3′，下遊序列：5′-GTACTTGCGCTCAGGAGG-3′，用反轉錄試劑盒進行cDNA的合成（按照說明書步驟進行）：合成後的cDNA進行擴增，方法如下：95℃ 3min，接著32個擴增循環：95℃ 30s、52℃ 30s、70℃ 30s，72℃ 3min；取PCR擴增產物6μL在2%的瓊脂糖凝膠中進行電泳，而後對凝膠進行圖像采集、分析，應用Photoshop CS6讀取灰度值，與β-actin相比，數值為各組mRNA相對表達量。
1.2.6 Western blot檢測膠原及Smad7表達：將成纖維細胞以2×105個接種在10cm培養皿中，經前述方法幹預48h後收集細胞，應用RIPA裂解液於冰上提取細胞總蛋白，離心並收集上清，用BCA法蛋白定量後調整蛋白上樣量並進行聚丙烯酰胺凝膠電泳，其後應用硝酸纖維素膜進行濕法轉膜，而後用5%脫脂奶粉封閉1 h，一抗（CollagenⅠ1：300稀釋，Smad7 1：200稀釋，GAPDH 1：400稀釋）4℃孵育過夜後，應用辣根過氧化物酶標記的二抗孵育2h。然後應用BCA蛋白分析試劑盒進行二抗顯影，以上每步之間均用TBST液洗5min/3次，利用Quantity One Version4.6.2圖像工作站進行圖像采集，應用Photoshop CS6讀取灰度值，與GAPDH相比後為各組蛋白表達相對值。
1.3 統計學處理
采用SPSS 19.0統計軟件包進行統計學處理，實驗數據以x±s表示，各組間數據比較采用t檢驗及單因素方法分析，P
2 結果
2.1 ASMq對增生性瘢痕成纖維細胞形態的影響
成纖維細胞的形態呈長梭形有較大的細胞體，胞質較豐富及呈現兩個或三個不同突觸長度的多角度形狀。與對照組相比，在TGF-β1+ ASMq（0.6mg/ml）組和TGF-β1+ ASMq（1.0mg/ml）組細胞數量減少，形態逐漸變圓和突觸逐漸變短或消失；且有較長的紡錘形結構和最大的胞體。
2.2 ASMq抑製TGF-β1誘導的成纖維細胞增殖
通過CCK-8法檢測經過ASMq（0.2mg/ml，0.4 mg/ml，0.6mg/ml，1.0mg/ml）與TGF-β1（5ng/ml）處理後24h、48h、72h的成纖維細胞增殖情況（表2）。與對照組相比，TGF-β1顯著刺激成纖維細胞增殖（P
2.3 ASMq對成纖維細胞相關mRNA水平的影響
RT-PCR檢測ASMq對成纖維細胞CollagenⅠ及Smad7基因表達的影響。
2.4 ASMq對成纖維細胞蛋白表達的影響
Western blot檢測ASMq對成纖維細胞CollagenⅠSmad7蛋白表達的影響。
3 討論
HS是皮膚纖維化過度的結果，這一過程有多種細胞因子參與其中，TGF-β1是目前已知與HS形成關係最密切的一種細胞因子，它的存在能顯著增加成纖維細胞的增殖及膠原的合成 [6-8]。治療方法主要有：手術切除、放療、激光及藥物，中藥治療一直是研究的重點。維吾爾族醫藥作為祖國醫藥重要的組成部分，而ASMq是維吾爾醫預防和治療各種疾病，如腫瘤、肝病、糖尿病、高血壓以及心血管疾病的有效處方，其療效顯著，它由菊苣子、芹菜根、菊苣根、香青蘭子、黑種草子等十餘味維藥調製而成。維醫實踐表明，ASMq可以減輕肝纖維化、肺纖維化疾病，而現代醫學認為增生性瘢痕為皮膚纖維化疾病，是全身纖維化疾病的一種，但其對瘢痕的作用機製一直以來都不清楚[9-11]。
TGF-β可分為TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 三種亞型，並通過與受體結合而發揮作用.其中TGF-β1在增生性瘢痕形成過程中尤為重要，其參與了創傷愈合的所有過程，產生細胞的趨化性遷移、增生分化、細胞外基質合成及分泌等重要的生物學效應[12-14]。TGF-β1可直接作用於成纖維細胞，體外低濃度的TGF-β1即可刺激成纖維細胞合成大量CollagenⅠ和細胞外基質。上述TGF-β1的作用可以通過激活由Smad介導的信號傳導途徑完成。然而TGF-β1分泌後必須經過激活才能發揮效應，即必須與其相應的受體蛋白TGF-βR相結合才能發揮其作用，而目前已知的TGF-βR主要Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型三種[15-16]。
Smads蛋白超家族是TGF-β信號傳導通路的下遊蛋白。它包括3類：①受體調節型Smads（receptor-associated Smads，R-Smad），包括Smad1、Smad2、Smad3、Smad5、Smad8；②共同通道型Smads（common-mediator Smads，Co-Smad），包括Smad4；③抑製型Smads（inhibitory Smads，I-Smad），包括Smad6和Smad7。Smads是一種中介分子，它能夠把TGF-β與其各型受體結合後產生的信號從胞質傳到細胞核內[15]。TGF-β信號分子通過跨膜的、具有絲氨酸-蘇氨酸激酶活性的受體複合物進行信號轉導。TGF-β與其受體TβRII結合後能夠激活TβRI受體，激活的TβRI受體使Smad2、Smad3蛋白磷酸化，磷酸化的Smad2、Smad3蛋白方能與Smad4形成具有生物活性的轉錄複合物進入細胞核內，調節相應靶基因的轉錄，I-Smads可與R-Smad競爭性結合受體，阻止R-Smad活化或抑製Smads多聚體形成而阻斷TGF-β的信號轉導[16-17]。
在筆者的研究中觀察到，TGF -β1組與對照相比成纖維細胞的增殖明顯活躍，這一結果與眾所周知的TGF-β1是成纖維細胞細胞功能和增殖的主要調節因子相符。而ASMq組與TGF-β1相比較發現前者細胞增殖又被顯著抑製，這說明ASMq對於TGF -β1誘導成纖維細胞增殖有抑製作用。而在RT-PCR及western blot實驗中筆者看到：TGF-β1能促進CollagenⅠ合成，抑製Smad7的表達；而ASMq降低了TGF-β1對Smad7合成的抑製作用，而在ASMq幹預下CollagenⅠ合成表達是顯著降低；由此，筆者推測ASMq通過促進增生性瘢痕成纖維細胞中Smad7表達來抑製細胞增殖及CollagenⅠ合成，即通過促進Smad7合成來抑製TGF-β/Smad通路信號轉導，降低了成纖維細胞增殖及CollagenⅠ合成，從而抑製增生性瘢痕的發生發展，本研究有助於明確ASMq對瘢痕作用機製，為筆者以後的實驗打下基礎，為維藥開展臨床預防及治療瘢痕提供充分的理論依據。