維藥異常黑膽質成熟劑對TGF—β1誘導增生性瘢痕成纖維細胞的影響
基礎研究
作者：朱瑞祥 李加輔 許言文等
[摘要]目的：研究維藥異常黑膽質成熟劑（abnormal savda munziq，ASMq）對TGF-β1誘導增生性瘢痕成纖維細胞的影響。方法：組織塊法體外培養人增生性瘢痕成纖維細胞，將其分為6組：對照組：加入等體積的培養液；實驗組：加或不加不同濃度ASMq（0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，1.0mg/ml）及濃度為5ng/ml的TGF-β1；CCK-8法檢測成纖維細胞增殖情況，應用western blot，RT-PCR檢測CollagenⅠ及Smad7表達情況。結果：ASMq降低了TGF-β1誘導的成纖維細胞增殖（P
[關鍵詞]異常黑膽質成熟劑；增生性瘢痕；成纖維細胞；TGF-β
[中圖分類號]R619+.6 [文獻標誌碼]A [文章編號]1008-6455（2015）11-0042-05
Abstract： Objective To investigate the effect of uighur medicine abnormal savda munziq on the TGF-β1 induced in hypertrophic scar fibroblasts. Methods Using tissue explant cultures of human hypertrophic scar fibroblasts， divided into six group：control group：add an equal volume of culture medium；and experimental group：treated with TGF-β1 with or without different concentration of ASMq（0.2 mg/ml，0.4 mg/ml，0.6 mg/ml，1.0mg/ml）.CCK-8 assay was adopted to detect the proliferation of fibroblasts.western blot and RT-PCR were performed to detect the expression of CollagenⅠand Smad7. Results ASMq reduced the TGF-β1 induced in fibroblasts proliferation（P
Key words：abnormal savda munziq；Hyperplastic scar；fibroblasts；TGF-β1
增生性瘢痕（Hypertrophic Scar， HS）是以膠原過度沉積為特征的一種病理現象，其誘發的具體機製是多樣的，組織學上以成纖維細胞的過度增生和細胞外基質的過度聚集為特征，常發生在外傷、外科手術或燒傷後，且臨床治療比較複雜和困難[1-3]，因此，HS的治療一直是研究的熱點。
筆者前期研究通過兔耳增生性瘢痕動物模型，采用灌胃、外用以及聯合應用ASMq，結果表明ASMq可以直接抑製成纖維細胞的生長增殖，降低兔耳增生性瘢痕組織塊的發生率[4]。並且ASMq對於體外培養增生性瘢痕成纖維細胞的增殖具有抑製做用（抑製於G0/G1期），這一作用隨濃度的變化而變化，同時發現它能促進成纖維細胞的凋亡[5]。本研究通過采用不同濃度的ASMq與TGF-β1對人增生性瘢痕成纖維細胞的幹預處理，檢測其對增生性瘢痕成纖維細胞增殖，CollagenⅠ及Smad7基因及蛋白表達的影響，為探索維藥抑製增生性瘢痕的作用機製及采用維醫維藥防治增生性瘢痕提供實驗和理論依據。
1 材料和方法
1.1 試劑及材料
異常黑膽質成熟劑（國藥準字：Z65020166）：新疆維吾爾藥業有限責任公司；DMEM培養基、胎牛血清（FBS）、胰酶、PBS緩衝液、青黴素和鏈黴素：美國Hyclone公司；人轉化生長因子β1（TGF-β1）：美國Pepro Tech公司；羊抗人CollagenⅠ及Smad7抗體：美國Santa Cruz公司；CCK-8試劑盒、BCA蛋白定量試劑盒、羊抗人GAPDH抗體：武漢博士德公司；反轉錄試劑盒：美國Thermo公司；BCA蛋白分析試劑盒：美國Pierce公司；引物設計：上海生工公司；Western-Blot係統、PCR擴增儀等：美國Bio-Rad公司，倒置顯微鏡：德國LEICA公司。
1.2 實驗方法
1.2.1 ASMq的溶解配製：用DMEM培養基溶解（DMSO輔助溶解並且其在終濃度中的含量不大於0.1%））異常黑膽質成熟劑，用含10%FBS的DMEM稀釋為0.2mg/ml、0.4mg/ml，0.6mg/ml、1.0mg/ml。
1.2.2 標本來源及鑒定：實驗所用增生性瘢痕組織均來源於新疆醫科大學第一附屬醫院燒傷整形外科，共8例，男5例、女3例，均為漢族，年齡20～39歲，平均28.75歲，均為燒傷愈合後創麵瘢痕持續增生3～12個月，經病理檢查確診為增生性瘢痕，所有患者均無嚴重係統性疾病及未經過抗瘢痕藥物治療。本實驗經新疆醫科大學第一附屬醫院倫理委員會審議通過，所有提供標本患者均簽署知情同意書。
1.2.3 成纖維細胞培養及處理：將術中切取的增生性瘢痕組織於無菌超淨台內以PBS液漂洗3遍，去除殘留的血液及其他混雜異物，仔細切除表皮及與之相連的部分瘢痕組織，以防止表皮細胞混雜。將增生性瘢痕組織修剪成1mm×1mm×1mm的組織塊，均勻接種於培養皿內，緩慢加入含體積分數10% FBS及青黴素（100U/ml）和鏈黴素（100μg/ml）的DMEM培養液，於37℃，體積分數5% CO2 飽和濕度條件下的培養箱中培養，每周換液2次。待組織塊周圍細胞長成致密單層後，胰酶消化並傳代培養，選擇3～6代的細胞用於實驗研究。在筆者以下的實驗中成纖維細胞在加藥幹預前均經過無血清DMEM 24小時均一化處理。以下實驗中所涉及的成纖維細胞均經過加或不加不同濃度ASMq（0.2mg/ml，0.4mg/ml，0.6mg/ml，1.0mg/ml）及濃度為5ng/ml的TGF-β1處理。
1.2.4 細胞增殖實驗：應用CCK-8試劑盒檢測成纖維細胞增殖情況。增生性瘢痕來源成纖維細胞經傳代後取對數期細胞以1×104個/孔細胞數接種於96孔板中，並加入200μl含10% FBS的DMEM培養過夜，而後經過預設方法處理，每組4個複孔，連續檢測24h、48h、72h各組細胞增殖情況，在檢測前4h每孔各加入20μl的CCK-8工作液，於37℃，體積分數5%CO2培養箱中孵育4h後用酶標儀讀取各孔在450nm處的吸光值（OD值），求平均值。