1.3.1 乙腈-水溶出法 此法是利用乙腈和水將一定質量的粉碎過篩的飼料樣品溶出,離心後準確量取一定體積的上清液置於分液漏鬥中,用正己烷提取二次後棄去,水層則用氯仿提取二次合並提取液,用鋪有脫脂棉與無水硫酸鈉的幹燥濾器過濾,而濾器又用氯仿3次洗滌,合並濾液與洗液於250mL蒸餾瓶中,40℃下減壓旋轉蒸發至於後,向殘渣中準確加入乙腈,使呋喃唑酮充分溶解,最後離心 10 min,清液上 HPLC檢測。因試樣是用乙腈提取,故呋喃唑酮的標準溶液和標準工作溶液也用乙腈溶解、定容,上HPLC後製作標準曲線。流動相則采用乙腈一0.05 M磷酸二氫鉀-三乙醇胺(30∶70∶1),pH=6.O,流速為1.0mL/min。由於呋喃唑酮微溶於氯仿,不溶於水,按照萃取過程的兩相分配理論,用氯仿進行萃取和洗滌提取不夠完全,加之此法操作步驟較多,造成不同程度的損失,故測定結果偏低。
1.3.2用乙腈一2%乙酸(蒸餾過的)+去離子水(20+ 80)作流動相流速控製為1.5 mL/min,用 DMF將 0.110±0.05 g呋喃唑酮樣品稀釋定容成 110μg/mL的中間標準液,再用等體積的 5%四乙基銨溴漠化物(TEAB)將中間液製成55μg/mL的標準工作液(需每日現配)。此法對配合飼料和預混料的前處理方法有異。檢測配合飼料,根據標準工作液的量稱取碾細混勻的樣品到蒸餾套管中,加入一定量的丙酮一水(93+7)的提取液,蒸餾提取8h以上(在蒸餾過程中若發現燒杯中有水,就應加入一定量的丙酮以除去所有的水)。蒸發完後,立即從氣浴上移開,加入DMF,再在氣浴上加熱使所有殘餘物溶解在DMF中。加入 5% TEAB,混合,將溶液注入離心管,冷卻後再於2000 r/min轉速離心數分鍾,取上清液,即為製得試液。檢測預混料,直接稱取樣品於錐形瓶中,準確加入 DMF,加蓋振搖 30 min,過濾提取物,用DMF稀釋到約含呋喃唑酮110 μg/mL。取等量5% ThAB和稀釋提取物,混勻,冷卻至室溫後於2000 r/min轉速離心數分鍾,取上清液,即為製得試液。此法盡管準確度較高,但操作較複雜,而且所用的流動相有較強的酸性,對色譜柱有一定的要求。
1.3.3用乙腈-甲醇(1+1)作為提取劑製備呋喃唑酮貯備液和工作液將乙腈一甲醇(1+1)準確加入裝有一定質量樣品的錐形瓶中,加蓋,於回旋振蕩器上振搖 30 min,過中性氧化鋁(活度為 1)層析柱,棄去前數mL流出液,取隨後流出的流出液過濾膜係統,待上HPLC檢測,若有必要用提取劑稀釋。此法所用流動相為乙酸鈉緩衝液(pH6.0)一乙腈(4+1),流速為 0.6mL/min。由於柱層析是靠重力或靜壓加速流動相流經色譜柱,分離的組分流程周期長,操作難以連續進行。故在實際應用中,我們在振搖靜置後,取提取液高速離心取上清液過有機相濾膜係統後,待上HPLC檢測。可結合具體儀器配置,選用流動相的比例調整為乙酸鈉緩衝液(pH6.0)一乙腈(70 %+ 30%),流速選用0.8 mL/min,測定結果較理想。
2呋喃唑酮測定過程中注意事項
2.l檢測條件 因呋喃唑酮對光敏感,所有操作都應盡量避光;配製溶液應在通風櫥內進行;試驗中所用貯備液貯於棕色瓶中,並於0-8℃冰箱中保存,有效期為1個月。工作液則每批樣品用時現配。
2.2檢測人員 在試驗中,操作人員應避免試液接觸皮膚和眼睛,避免吸入粉末。一旦進入眼睛應立即用水衝洗 15 min以上;一旦接觸皮膚,應立即用肥皂或柔和的洗滌劑洗去。