樣品的提取一般使用水和酸化有機溶劑，兩者可以同時達到脫蛋白和萃取殘留的目的。加拿大HAL使用鎢酸鈉、硫酸和水從組織中提取青黴素並脫掉蛋白質。這種方法對牛奶中的青黴素效果非常好。樣品經提取後要進行蛋白質沉澱。脫蛋白的常用有機溶劑有甲醇、乙腈和2一丙醇；無機酸有硫酸和鎢酸鈉、酸化乙腈（pH4.0－4.4），以及超濾法等。Bioson等通過把青黴素萃取入水相中，在硫酸和鎢酸鈉的存在下，已能減少幾種非極性化合物的汙染，得到比較幹淨的水提取液。為了從生物體液和動物組織中提取青黴素殘留，Barker等提出了基體固相分散技術（MSPD），即把樣品基體與固相填料（如C18填料）混合攪拌均勻，然後把攪拌均勻的物質填充到層析柱中，用適當的溶劑淋洗上層分析物。
通常，得到的水提取液或有機提取液中，目標分析物濃度都很低，還含有許多共萃物，如果這些物質在最終的溶液中存在，不僅會損害色譜儀器，也會增加檢測的噪音，無法測定痕量濃度的目標分析物。為了降低背景化合物的幹擾，通常需要對目標分析物進行淨化與濃縮。常用的淨化和濃縮方法有離子交換（IE）、固相萃取（SPE）和免疫親合色譜法（IAC）。Moats等在分析青黴素殘留時，首次嚐試把自動在線痕量富集的方法用於樣品淨化。這種半自動化技術使用餾分收集器收集色譜淋洗液中預先確定的餾分。把收集到的餾分濃縮後，再進行液相色譜測定。此法已用於測定牛奶中的羥氨苄青黴素，鄰氯青黴素和苯氧甲基青黴素。氨苄青黴素和羥氨苄青黴素。
殘留組分的分離方式包括正相、反相和離子交換等幾種分離手段。近幾年來大都改用反相色譜法，最常用的分析柱填料為ODS－C18。反相HPLC具有高效、短時，並在含水係統中完成分析等特點。某些含有立體異構體的藥物，如氨苄青黴素、苯氧乙基青黴素以及羧苄青黴素等，也可用離子對反相（RP）HPLC來改善其分離效果。但對強極性的青黴素類藥物，如頭孢三嗪，分離效果不甚理想。在流動相中加入離子對試劑，以改善其分離的選擇性。
青黴素藥物被分離後，最常用的檢測方式為濃度型的紫外檢測器和熒光檢測器。彭莉等報道了用高效液相色譜法（HPLC）檢測牛奶中氯黴素的殘留量，采用乙酸乙酯提取牛奶中殘留的氯黴素，用正烷一氯仿（1+1， V/V）溶解殘渣，以乙腈一0.005mol/l磷酸氫二銨（l＋ 82， V/V）作為流動相，用高效液相色譜儀紫外檢測器在278nm檢測。平均加收率94.8%，變異係數＜12.0%。樣品前處理簡單、回收率高、實用性強、檢疫靈敏度高、重視性好、檢測數據準確可靠，可作為牛奶中氯黴素殘留檢測的確證方法。由於奶樣中藥物殘留量少，背景幹擾往往很嚴重，因此一般都使用柱前或柱後衍生技術，通過柱前衍生反應可以有效地提高紫外檢測器檢測殘留的靈敏度。目前，隨著接口技術的顯著改進，質譜作為一種質量流速型檢測器，正廣泛應用於殘留分析的檢測中。電化學檢測器也已用於檢測鄰氯青黴素、頭孢菌素和青黴素。
由於其固有的高靈敏度，熒光檢測法在多數LC分析中要優於紫外檢測法。Terada利用氨苄青黴素在甲醛和三氯乙酸溶液中形成能產生熒光的衍生產物的原理，用熒光檢測器，測定牛奶中氨苄青黴素殘留量。這不僅提高了方法的選擇性，而且靈敏度可達1μg/l。此外還有用 dansylaziridine、9一芴基甲基氯甲酸酯和4一溴甲基一7甲氧香豆素為衍生化試劑的報道，但由於受到多種因素的限製，應用並不多。盡管測定原理不同，但樣品的前處理步驟並沒有多大區別，都要經曆樣品的提取、脫蛋白、離心、層析柱淨化、衍生化等步驟，而所選用色譜柱均為反相柱，流動相為有機溶劑和磷酸鹽緩衝液。總之，液相色譜法測定牛奶中藥物殘留的方法正逐漸成熟起來。
2.2.2色/質聯用法
色/質聯用法由於實現了高效層析分離和檢測聯機，可用微電腦控製層析條件、程序和數據處理，其特異性、靈敏度和重複性均好，並可一次同時完成同一樣本中多種藥物及其代謝物檢測。對分析牛奶中青黴素類抗生素，質譜作為一種專一檢測器已獲得廣泛應用。其分析方式有直接探頭分析法、直接液體導入法、GC/MS、LC/MS聯用法等。使用電子轟擊離子化、化學電離、快速原子轟擊、熱噴霧電離、等離子體噴霧、粒子束電離、大氣壓化學電離（APCI）和電噴霧電離（ESI）技術對不同MS離子源條件下青黴素類藥物分子碎片類型的特征已經作了大量的工作。另外離子阱質譜技術（MS/MS）也已用於鑒別青黴素類藥物。
1991年，Tyczkowska等曾用熱噴質譜技術鑒別了牛奶中的青黴素G。該方法使用苯氧甲基青黴素作內標，牛奶樣品用鎢酸鈉沉澱蛋白後，上清液用Bond Elut C18SPE固相柱淨化，用乙腈一0.0125mol/l醋酸胺（60＋ 40）洗脫青黴素。洗脫液直接用 TSP/MS測定。測定低限為0.005mg/kg。Bioson使用TSP/LC/MS對牛奶和動物組織中殘留的青黴素進行測定和確證。後來又使用連接紫外檢測器的LC/TSP/MS確證了牛奶中的青黴素G。