荻MsFT1及MsFT2基因的克隆及序列分析
農藝學
作者：龍衛 艾辛 蔣建雄等
摘要 FT（Flowering locus T）基因是最初在擬南芥中發現的一個控製光周期途徑開花的一個關鍵基因，禾本科水稻中發現Hd3a（Heading date 3a）基因被證明與FT的同源且功能相同。該研究采用同源序列法通過水稻Hd3a的mRNA序列在近緣物種甜高粱基因組序列中進行BLAST得到cDNA序列進行引物設計，從禾本科芒屬荻中克隆出2條FT的同源基因，命名為MsFT1和MsFT2。MsFT1全長543 bp，編碼181個氨基酸；MsFT2全長540 bp，編碼180個氨基酸。MsFT1和MsFT2的堿基序列相似性達98%，推導的氨基酸序列相似性達97%，均含有PEBP特異結構域。通過clustal軟件將MsFT1和MsFT2與其他物種FT基因比較顯示與甜高粱的相似性最高達98%、96%，其次是玉米、小麥、水稻等禾本科植物相似度較高。將MsFT1和MsFT2氨基酸序列和水稻FT家族18個成員進行對比，MsFT1及MsFT2屬於FT家族中的FT-like亞族，且與Hd3a處於同一進化分支上。
關鍵詞 荻；光周期；Hd3a；FT
中圖分類號 Q785 文獻標識碼 A 文章編號 1007-5739（2015）08-0009-04
Abstract FT（Flowering locus T）gene was originally discovered in Arabidopsis as a photoperiodic control of flowering，It′s a key pathway genes.Hd3a（Heading date 3a）which was found in rice grassy was proven to be a homologous genes of FT and had the same feature.In this study，we designed primer by homologous cDNA sequence in sorghum.Two homologous genes of FT were cloned in the species of Miscanthus sacchariflorus，named them MsFT1 and MsFT2.MsFT1 had full length of 543bp，encoding 181 amino acids；MsFT2 had full length of 540 bp，encoding 180 amino acids.The sequence of MsFT1 and MsF2 were of 98% the same，and they both had the spatial structure of PEBP.When MsFT1 and MsFT2 were compared with other species′ FT gene，They had more than 98%，96%similarities with sorghum，followed by corn，wheat，rice and other grasses.When comparing MsFT1 and MsF2 with rice FT/TFL1 family，MsFT1 and MsFT2 both belong to FT-like subfamily，and were at the same evolution branches with Hd3a.
Key words Miscanthus Sacchariflorus；photoperiod；Hd3a；FT
植物的開花除受到內部因素影響外，外界環境因子如光照等通過誘導植物自身相關開花基因的表達調控[1]對開花產生影響。光敏感植物在適宜的日照長度下通常要經過一定時間的誘導後才能完成成花轉變，這種光照時長決定開花時間的現象稱為光周期現象。Garner等[2]在煙草晚花突變的研究中就發現了植物光周期現象，隨後，研究者們也發現了水稻、擬南芥等多種植物中光周期反應的存在[3]。1936年Chailakhyan根據嫁接試驗提出開花素概念[4-6]，認為在不同的植物中存在某種相同物質在光周期途徑起促進作用。植物成熟葉片感受光周期信號並產生這種物質，刺激該物質從葉片到莖尖進行長距離運輸，最終引起莖頂端成花反應。最近研究證明，FT蛋白產物就是開花素[7-9]。
隨著對植物光周期反應的研究，已在多種植物中分離出FT同源基因。FT的轉基因過表達可促進植物早花[10-12]，進一步確定FT 基因開花素的本質。FT受上遊光周期誘導的CO（CONSTANS）基因激活調控表達[13]，表達產物從葉片移動到頂端組織後與一個帶堿性亮氨酸拉鏈蛋白（basicregionleucine-zipper，b-ZIP）結構域的轉錄因子蛋白FD（FD 在頂端分生組織中特異表達）相互作用，共同促進下遊成花基因AP1的表達從而促進開花[14]。荻是一種能源植物，為短日照植物[15]，荻開花早晚極重要，不僅影響生物產量，且影響荻是否能順利越冬。該研究通過對荻FT基因的克隆，初步了解荻光周期開花基因FT相關內容，為深入研究荻光周期調控途徑打下基礎。
1 材料與方法
1.1 試驗材料及光周期誘導
試驗材料為原生長地為東北吉林的荻，2007年移栽種植於湖南農業大學芒屬資源圃內，田間編號為B0232L。2012年3月初，材料未出苗前在田間挖取荻根狀莖埋種於高45 cm、口徑40 cm的塑料花盆中，放置於光周期調控室，調節溫度為20～25 ℃，培養到葉片數為10片左右時對材料進行遮光處理，調整光照條件為（8 h光照，16 h黑暗），其他條件保持不變。培養4周後取材料完全展開嫩葉，凍置於液氮後存放於-70 ℃超低溫冰箱中，提取mRNA。
1.2 MsFT1及MsFT2基因的克隆
1.2.1 RNA的提取和cDNA的製備。總mRNA的提取采用改良的 TRIzol法，稱取100 mg左右的葉片剪碎置於研缽中，加液氮進行研磨至粉末狀後，轉移到2.0 mL的去酶EP管中，加入1 mL TRIzol（TianGen）提取液和20 μL的巰基乙醇，漩渦振蕩1 min，混勻後靜置5～10 min，再加入200 μL的氯仿漩渦振蕩30 s，靜置5 min，其他步驟按TRIzol試劑盒的步驟進行。得到乳白色mRNA沉澱後加入30 μL的DEPC處理水溶解，取2 μL進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，確定提取的mRNA條帶符合要求後，再進行下一步用Dnase I（Thermo）的消化，cDNA的第1條鏈合成采用Thermo公司提供的試劑盒（具體步驟按照其說明書進行）。
1.2.2 克隆基因引物的設計。通過在NCBI水稻蛋白質數據庫中輸入Hd3a得到（登錄號：NM_001063395）蛋白質序列在甜高粱蛋白質數據（http：//www.phytozome.net/index.php）中搜索得到甜高粱的cDNA全長序列後，用Premier5.0軟件設計引物，3條正向引物為MSFT-F、MSFT-c、MSFT-d，3條反向引物為MSFT-F、MSFT-a、MSFT-b，3對引物組成5種組合，進行PCR擴增。
1.2.3 PCR擴增與克隆測序。將合成好的cDNA稀釋10倍後作為PCR擴增的模板，采用20 μL體係，模板cDNA取1 μL，10 μmol/L的正反引物各1 μL，10×Taq緩衝液（Mg+Plus）2 μL，DNTPMIX 1.2 μL，Taq DNA聚合酶1 U，再加入滅菌的ddH2O補足20 μL，PCR體係反應條件為94 ℃ 3 min；94 ℃ 30 s，53 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個循環；72 ℃ 延伸10 min。PCR後經凝膠電泳檢測，將得到的與預計大小相符片段分別進行切膠回收。PCR產物回收采用Omega Bio-Tek公司提供的核酸純化試劑盒，具體操作均按說明書步驟進行。產物回收後，將產物與PTZ57R/T載體相連接，具體操作步驟按克隆試劑盒（Thermo）上說明進行，載體由試劑盒提供。載體連接後，以感受態大腸杆菌DH5A作為受體進行轉化，采用藍白斑進行篩選，挑取白色的單菌落擴增，將PCR檢測為陽性的克隆送往上海桑尼生物科技有限公司進行測序，每個PCR產物10個重複。