基於SRAP和SNP分子標記的國內穿心蓮遺傳多樣性分析
資源與鑒定
作者：陳蓉 王曉雲 宋毓寧 朱雲峰 王鵬良 李敏 鍾國躍
[摘要]為了闡明國產穿心蓮的遺傳多樣性以及探討遺傳背景對穿心蓮藥材質量的影響，利用110對SRAP引物和1對SNP特異性引物，對我國7個省份13個樣地的103份穿心蓮樣品進行遺傳多樣性分析。采用Powermarker V3.25和Mega 6.0軟件分析群體的遺傳結構，CodonCode Aligner軟件分析功能基因單核苷酸多態性變異。聚類分析結果表明各穿心蓮樣品的遺傳距離範圍為0.01～0.09，CPS基因片段中未檢測到SNP位點，國產各地穿心蓮種質間遺傳多樣性較貧乏，這與穿心蓮嚴格的自花授粉繁殖特性、我國各地引種穿心蓮種源來源單一密切相關。遺傳背景並非影響各地穿心蓮質量差異的主要原因，穿心蓮的良種選育以采用突變育種、多倍體育種和分子育種等方法為宜。
[關鍵詞]穿心蓮;SRAP分子標記;SNP分子標記;遺傳多樣性
穿心蓮為常用中藥，來源於爵床科植物穿心蓮Andrographis paniculata（Burm.f.）Nees，以地上部分入藥，具有保肝利膽、抗腫瘤、抗氧化、清熱解毒、抗菌消炎、消腫止痛等多種作用，臨床常用於中止妊娠，治療瘧疾、毒蛇咬傷、糖尿病和高血壓等心血管疾病[1]。穿心蓮主要含有二萜內酯類化合物，有廣譜抗菌和抗病毒作用，有“天然抗生素”之稱。據印度1885年的史料記載，穿心蓮原產於印度半島和斯裏蘭卡[2-5]，在東南亞國家以及我國廣為引種栽培[6-7]。由於大量采挖導致野生資源急劇減少，已被列為印度國家保護物種。作為重要的藥用資源，自2001年，斯裏蘭卡規定禁止穿心蓮的出口[8]。之後，印度、馬來西亞等國家也紛紛對穿心蓮種質資源實行了保護[1，9-10]。我國引種栽培穿心蓮的確切時間已無法考證，但穿心蓮作為中藥首見《嶺南采藥錄》（1932年）以“春蓮秋柳”之名記載[11]，至少應有80年以上曆史。穿心蓮目前主產於兩廣和福建，但北至陝西、長江南北各地多有引種栽培。有研究報道全國不同產地穿心蓮的主要活性成分差異較大，藥材質量參差不齊[12-14]，這種品質差異可能受到種質遺傳背景、產地生態、栽培技術及采收時期等多方麵因素的影響，同時也對穿心蓮的良種選育提出了需求。
SRAP（sequence-related amplified polymorphism，相關序列擴增多態性）分子標記是分析植物材料遺傳背景的有力工具。SNP（single nucleotide polymorphism，單核苷酸多態性）分子標記用於研究基因功能具有重要意義。穿心蓮內酯是穿心蓮的主要活性成分，在其生物合成中的一個關鍵步驟是焦磷酸香葉基香葉酯（GGPP）環合形成ent-焦磷酸古巴酯（ent-CPP），從而形成穿心蓮內酯的母核結構，而催化這個環合反應的二萜合酶——ent-柯巴基焦磷酸合酶（ent-copalyl diphosphate synthase，CPS），是影響穿心蓮內酯生物合成的關鍵限速酶。有學者利用SSCP技術，在泰國分布的穿心蓮中，檢測到CPS基因內部存在1個SNP位點[15]。本研究利用SRAP和SNP分子標記研究我國穿心蓮不同種群的遺傳結構和親緣關係，以探索各地穿心蓮質量差異的遺傳背景，探究國內穿心蓮種群的進化潛力，為其種質資源保護和良種選育提供科學參考。
1材料
SRAP分析的103份樣品采自7個省份13個采樣地（均為栽培地采樣），采集單株的新鮮葉片，立即裝於自封袋，並加入矽膠幹燥劑保存備用。
從13個采樣點中，各隨機選取2份共計26份用於SNP分析（其中64號樣品僅采集1份，故用同時采集的種子育苗取葉，補充1份）。
所有樣品經江西中醫藥大學曹嵐副教授鑒定為爵床科植物穿心蓮A.paniculata，憑證標本存於江西中醫藥大學民族傳統藥現代科技與產業發展協同創新中心標本室。
2×Taq PCR MasterMix，10×Ex Taq Buffer，TaKaRa Ex Taq，dNTP Mixture，DNA Marker DL2000均購自天根生化科技（北京）有限公司，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成。電泳試劑購自生工生物工程（上海）股份有限公司。利用Bio-Rad MJ PTC-200型PCR儀進行擴增，北京六一廠生產的垂直膠電泳係統進行PAGE膠的製備與電泳。
2方法
2.1基因組DNA的提取利用天根生化科技（北京）有限公司的植物基因組DNA提取試劑盒（DP305-02）提取基因組DNA。
2.2SRAP擴增體係和程序 SRAP分子標記擴增所用引物共110對[16]。PCR擴增體係為10μL，包括2×Taq Master Mix5μL，上、下遊引物各0.2μL，DNA模板2μL，加水補足到10μL，。PCR擴增程序為：94℃3min;94℃1min，37℃1min，72℃2min，循環5次;94℃1min，50℃1min，72℃2min，循環35次;72℃5min。
用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳檢測擴增產物，電泳結束後采用銀染法進行染色。染色方法為：去離子水衝洗凝膠2遍，用0.1%硝酸銀溶液滲透10～12min，自來水漂洗2次;用2%的氫氧化鈉和1%的甲醛混合液顯色，至譜帶清晰;將凝膠置於膠片觀察燈上進行記錄條帶。
2.3SNP分子標記擴增體係和程序為方便測序需要，在原文獻報道基礎上，設計1對SNP分子標記擴增引物AP-CPS-F2：CTCAGTTTCCCACCAGCATC和AP-CPS-R2：AGGCACTCTTCAATCTCAGGT。引物擴增產物覆蓋了報道中檢測到SNP的CPS基因區段，並向該區段上下遊各延伸了至少100bp[14]。PCR擴增體係為50μL，包括10×Ex Taq Buffer（20mmol·L-1Mg2+Plus）5μL，TaKaRa Ex Taq（5U·μL-1）0.25μL，dNTP Mixture4μL，上、下遊引物各1μL，DNA模板8μL，加水補足到50μL。PCR擴增程序為94℃3min;98℃10s，55℃30s，72℃1.5min，循環33次;72℃10min。
2.4數據統計分析以A/A，B/B統計SRAP擴增帶型，在相同遷移率位置上有帶記為A/A，無帶記為B/B。Powermarker V3.25軟件采用基於Nei′s（1979）遺傳距離的鄰接法（Neighor-joining，NJ）進行聚類分析，MEGA6.0軟件進行聚類圖繪製。
對於SNP擴增產物選擇直接測序，利用CodonCode Aligner軟件對測序結果進行分析。
2.5遺傳多樣性分析遺傳多樣性分析采用國際上通用的多態性信息量（polymorphism information content，PIC）。PIC按照Anderson等[17]的方法計算，對於標記i的PIC計算公式為：
PIC=1-∑1j=1p2ij
其中，Pij表示標記i的第j種帶型出現的頻率，標記i的總帶型從1到n。PIC的大小在0～1，0表示無多態性，1表示具有非常高的多態性。
3結果與分析
3.1多態性SRAP引物篩選在110對SRAP引物組合中有68對表現出多態性，共產生擴增片段763條，其中多態性片段為181條，多態性位點占23.72%。每對引物組合檢測等位基因數1～12個，平均為2.70個，多態性比率平均為22.70%。擴增條帶數最多的引物組合為me10-em11，多態性比率最高的引物組合為me10-em9。表明這68對SRAP分子標記引物用於穿心蓮種質資源的遺傳背景分析是有效的。
3.2不同地理來源穿心蓮的遺傳多樣性水平分析按照不同地理來源將穿心蓮資源分為11組，檢測各組的遺傳多樣性水平。結果表明各地區穿心蓮的遺傳多樣性水平為廣西隆安>廣西貴港>四川江南>廣西橫縣>四川裴石>廣東雷州>安徽牛莊>福建龍海>福建漳浦>安徽潭棚>廣東遂溪，主等位基因頻率、基因型數、基因多樣性、多態性信息量，廣西隆安都是最高的（表3）。
3.3基於Nei′s遺傳距離的係統發育分析利用Powermarker V3.25軟件和Mega6.0軟件，對來源於不同地區的103份穿心蓮建立了基於Nei′s遺傳距離的N-J係統發生樹。
根據材料來源所屬地理區域進行聚類，結果顯示，各地區穿心蓮樣品的遺傳距離為0.01～0.09，均小於0.1，在遺傳距離0.01時，13份材料又可分為3類。第1類包括廣東雷州和雲南景洪，第2類包括四川裴石、四川江南、廣西隆安、廣西貴港、廣西橫縣、安徽牛莊、安徽潭棚和海南，第3類包括福建龍海、福建漳浦和廣東遂溪。以上數據表明遺傳距離很小;同一個省份的穿心蓮品種並沒有完全歸到一類，而是和其他省份的聚到一起，栽培種相似性較高，可能品種混雜的情況較嚴重，並具有相同的起源。
根據單株進行聚類，可分為3大類，第1類包括70，71，79，93～95，其中70，71來自福建龍海，79來自福建漳浦，93～95來自廣東雷州。第2類包括65～69，72，77，78，80～82，87～92，96，其中65～69，72來自福建龍海，77，78，80～82來自福建漳浦，87～91來自廣東遂溪，92，96來自廣東雷州。第3類包括的樣品來自全部采樣點。結果表明，103號樣品的聚類與其地理分布並未表現出明顯的相關性，每個地理分布區域內均存在各種類似的基因型，提示各地理分布區樣品在基因型上並無明顯的差異（圖2）。