新疆紫草PAL，HMGR，PGT基因的過表達和RNA幹擾載體的構建
資源與鑒定
作者：謝騰 劉玉忠 王升 劉談 康利平 郭蘭萍
[摘要]新疆紫草Arnebia euchroma是藥用紫草的主要來源，其最重要成分紫草素類化合物具有很高的藥用和工業價值。研究采用GATEWAY技術，構建新疆紫草次生代謝關鍵酶基因PAL，HMGR，PGT的過表達載體和RNAi載體，為相關轉基因株係的構建搭建好平台。新疆紫草次生代謝關鍵酶基因過表達和RNA幹擾載體的構建，是基於遺傳物質的遺傳研究平台的搭建，對於次生代謝途徑上基因功能驗證和功能基因的挖掘提供了極大的便利，同時也填補了新疆紫草在轉基因領域研究的空白，對於培育紫草素高產株係具有重要意義。
[關鍵詞]新疆紫草;過表達載體;RNAi載體;GATEWAY技術
[收稿日期]2014-06-18
[基金項目]國家自然科學基金項目（81130070，81072989）;國家科技支撐計劃項目（2012BAI29B02，2012BAI28B002）
[通信作者]郭蘭萍，Tel：（010）64011944，E-mail：[email protected]
[作者簡介]謝騰，碩士，Tel：18310830559，E-mail：[email protected]
新疆紫草Arnebia euchroma （Royle）Johnst是藥用紫草的主要來源[1]，其重要成分紫草素類化合物具有止血、抗癌、抗HIV等多種藥理活性[2-4]，同時也是天然的化工染料和食品添加劑[5-6]。
紫草素類化合物通常認為是在限速酶苯丙氨酸解氨酶（PAL）、甲戊二羥酸單酰輔酶A還原酶（HMGR）和對羥基苯甲酸香葉基轉移酶（PGT）催化下，通過苯丙氨酸（phenylpropan-oid，PP）-甲羥戊酸（mevalonate，MVA）複合途徑合成。PAL是PP途徑中的起始代謝酶，催化L-苯丙氨酸生成反式肉桂酸，進而開啟對羥基苯甲酸（PHB）的合成。MVA途徑上的HMGR將甲戊二羥酸單酰輔酶A還原為甲戊二羥酸，進而生成PP和MVA途徑的中間產物焦磷酸香葉酯（GPP）。最後PHB，GPP在PGT的催化下合成紫草素類化合物前體香葉基-對羥基苯甲酸（GHB）[7-8]。
次生代謝通路上關鍵酶基因表達的變化會影響次生代謝物的生物合成，可以通過改變某特定基因的表達來調節下遊次生代謝，即基因的過表達（或超表達）和RNA幹擾（RNA interference，RNAi）技術，控製目標代謝產物的合成。為此，本研究擬構建新疆紫草次生代謝途徑中關鍵酶基因PAL，HMGR，PGT過表達和RNA幹擾載體，為培育新疆紫草次生代謝物高產株係和次生代謝相關基因的功能驗證奠定基礎。
1材料
新疆紫草愈傷細胞取自中國科學院植物研究所葉和春研究員處。
基因過表達載體pH7WG2D和RNA幹擾載體pK7GWIWG2D均由中國中醫科學院中藥資源中心提供。
2方法
2.1目的基因序列的獲取和引物設計
在NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）下載目的基因序列：PAL（gi|90994675），HMGR（gi|91208650），PGT（gi|158957516）。
過表達載體的片段為目標基因的全長，引物位於ORF外，RNA幹擾的片段引物位於ORF內。使用Primer Premier5分別設計含CACC接頭和不加CACC接頭的合適引物。
2.2新疆紫草cDNA的獲得
采用Trizol法新疆紫草愈傷組織細胞總RNA提取，並做RNA質量檢測。使用TaKaRa PrimeScript 1st strand cDNA Synthesis Kit試劑盒，將新疆紫草新鮮RNA反轉錄為單鏈cDNA，並至於-20℃保存。
2.3PCR擴增
2.3.1通用PCR擴增使用TaKaRa Ex Taq酶做普通PCR擴增，所用引物不加CACC接頭。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測並測序。
2.3.2菌液PCR擴增使用TaKaRa Taq酶做菌液PCR擴增，所用引物不加CACC接頭。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測並測序。
2.3.3高保真PCR擴增使用Phusion High-Fidelity DNA Polymerase PCR酶做高保真PCR擴增，以T載體克隆所得質粒為DNA模版，所用引物含CACC接頭。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測並測序。
2.4PCR產物的回收與純化
PCR擴增產物回收與純化使用生工SanPrep柱式DNA膠回收試劑盒。將所得到的DNA保存於-20℃。
2.5PCR產物的T載體克隆
PCR產物的T載體克隆使用Promega的pGEM-T EasyVector Systems，4℃水浴過夜，轉入DH5α，LB平板（氨苄黴素，Amp抗性）培養過夜，篩選菌落並菌液PCR驗證。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測並測序。
2.6轉化大腸杆菌
選擇Trans5α感受態細胞，吸取200μL已轉化的感受態細胞加到含相應抗生素LB瓊脂培養基上，均勻塗開細胞，至液體被吸收，倒置平板，37℃過夜培養。篩選菌落並菌液PCR驗證，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測並測序。
2.7質粒提取
質粒DNA提取使用QIAprep Spin Miniprep Kit試劑盒。
2.8GATEWAY方法構建載體
GATEWAY技術是基於λ噬菌體位點特異性的成熟重組體係，由BP，LR2個反應就構成，可同時轉化多個基因，較其他載體構建方法快捷高效[9]。BP反應將目的基因從PCR產物重組到供體載體，從而形成入門載體（donor vector），LR反應則將入門克隆重組入目的載體（destination vector）[10-11]。
2.8.1BP連接反應使用Invitrogen公司pENTRTM SD/D-TOPO Vector做入門載體連接高保真PCR產物。在微量離心管中配製BP反應混合液（3μL體係）：1.5μL ddH2O，0.5μL 高保真PCR產物，0.5μL salt solution，0.5μL入門載體。22℃水浴3h，轉入DH5α，LB平板（卡那黴素，Kana抗性）培養過夜，篩選菌落並菌液PCR驗證。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測並測序。
2.8.2LR連接反應選擇BP反應測序成功的質粒，進行LR反應。使用Invitrogen公司LR Clonase Ⅱ enzyme mix介導目的基因從入門載體的連接到入門載體。過表達載體為pH7WG2D，RNA幹擾載體為pK7GWIWG2D，在微量離心管中配製LR反應混合液（4μL體係）：1μL入門克隆（50～150ng），1μL目的載體（150mg·L-1），1μL LR ClonaseⅡenzyme mix，1μL ddH2O。25℃水浴12h，加入1μL proteinase K solution，37℃水浴5min，終止LR反應。將LR連接產物轉入DH5α，LB平板（壯觀黴素，Spe抗性）培養過夜，篩選菌落並菌液PCR驗證。1%瓊脂糖凝膠電泳檢測並測序。
3結果
3.1引物合成
依據NCBI提供的新疆紫草PAL，HMGR，PGT的cDNA序列，設計並合成目的基因過表達載體和RNA幹擾載體構建所需cDNA擴增特異性引物，見表1。
3.2T載體克隆
將已純化的過表達和RNAi基因PCR產物與pGEM-T Easy Vector連接，並將產物轉入DH5α進行菌液培養，菌液PCR獲得目的基因的T載體質粒。
3.3過表達和RNA幹擾載體的構建
3.3.1高保真PCR以構建好的pGEM-T質粒為模板，使用加有CACC的特異性引物，用高保真酶Phusion High-fidelity進行PCR擴增，獲得過表達基因全長和RNA幹擾基因片段，PCR產物進行純化後，進行下一步的BP反應。