中藥生物藥劑學分類係統中多成分環境對葛根素滲透性的影響
中藥生物藥劑學分類係統專題
作者：劉洋 王剛 董玲 唐明敏 朱美玲 董紅環 侯成波
[摘要] 中藥生物藥劑學分類係統（biopharmaceutics classification system of Chinese materia medica，CMMBCS）中的滲透性評價，需多成分作為整體來開展研究，即使在研究具體某一成分時，也應將其放在多成分環境中審視。該實驗以此為原則，將葛根芩連湯中的高含量成分作為多成分環境影響因素，考察葛根素的腸滲透性，運用在體腸單向灌流模型，對葛根素腸滲透性的相關參數進行測定，評價其他高含量成分對其腸滲透性的影響。實驗結果表明不同比例的黃芩苷、甘草酸和小檗堿對葛根素的腸滲透性均有一定的影響，甘草酸能顯著抑製葛根素的腸吸收，高濃度小檗堿會促進葛根素的吸收。該研究結果表明中藥生物藥劑學分類係統的滲透性評價充分考慮多成分環境中其他成分的影響是重要的研究思想。
[關鍵詞] 葛根素；多成分環境；在體腸單向灌流；腸滲透性
[收稿日期] 2014-07-18
[基金項目] 國家自然科學基金項目（81473362）
[通信作者] *董玲，副研究員，碩士生導師，主要從事新劑型給藥係統研究，Tel：（010）64286245，E-mail
[作者簡介] 劉洋，副教授，碩士生導師，主要從事藥物代謝研究，Tel：（010）84738629，E-mail
中藥無論是單味藥還是複方，均含有眾多化學成分，多成分是中藥製劑臨床使用的基本特征[1]。多數中藥的臨床作用是多成分被口服吸收後顯現的，中藥內含的某單一成分都處於受其他成分影響的多成分環境中，其吸收必定受到多成分環境的影響[2]。目前文獻中報道的中藥單體成分滲透性研究較為多見[3]，但以多成分為整體，研究某一成分滲透性時，充分考慮其他多成分影響的研究仍舊少見。而中藥生物藥劑學分類係統中用於分類的滲透性評價就應客觀地在多成分環境中考察。目前美國FDA、歐盟EMA乃至中國CFDA，對多成分環境中單一成分的滲透性評價皆無規定。所以，本研究的目的是探索多成分環境對成分腸滲透性的影響，豐富CMMBCS的同時，也為藥品管理部門提供參考。
化學成分的滲透性研究可采用體外Caco-2細胞模型[4]、間接體內尤金池實驗[5]、人體[6]及動物在體腸灌流等技術開展。鑒於鼠小腸吸收與人類小腸吸收的相似性，及鼠小腸吸收模型所得的數據與人類小腸吸收的良好相關性[7-8]，本實驗采用大鼠進行實驗。並通過課題組前期的係統實驗方法分析[9]，結合FDA已認可大鼠小腸單向灌流實驗作為BCS中滲透性分類[10]依據的現實，故本研究滲透性實驗中采用大鼠在體腸單向灌流技術實施。
1 材料
1.1 儀器
Waters液相色譜係統（600四元泵，美國Waters公司），2487雙波長紫外檢測器，Empower2工作站；BT-25S電子分析天平（北京賽多利斯儀器有限公司）；BT100-1F注射泵（保定蘭格恒流泵有限公司）。
1.2 藥物與試劑
葛根素對照品（批號110752-200912，中國食品藥品檢定研究院）；葛根素原料（批號120504，陝西中鑫生物技術有限公司）；黃芩苷原料（批號ZL-A-018，南京澤朗醫藥科技有限公司）；鹽酸小檗堿原料（批號120212，陝西中鑫生物技術有限公司）；甘草酸單銨原料（批號GU20120611，武漢金諾化工有限公司）。乙腈（色譜純，美國Fisher），娃哈哈純淨水購買於娃哈哈集團公司（中國杭州），其他試劑均為分析純。Krebs-Ringer′s營養液（K-R液）：稱取NaCl 7.8 g，KCl 0.35 g，CaCl2 0.37 g，NaHCO3 1.37 g，NaH2PO4 0.32 g，MgCl2 0.02 g，葡萄糖1.4 g，加去離子水定容至1 000 mL，即得。
1.3 動物
Wistar大鼠，雄性，體重200～250 g，北京維通利華試驗動物技術有限公司提供，許可證號 SCXK（京）2012-0001。
2 方法
2.1 溶液的配製
2.1.1 對照品溶液製備 精密稱取葛根素對照品10 mg，置10 mL量瓶中加入不同的溶出介質適量，置超聲儀中使完全溶解，加溶出介質至刻度，搖勻，製成質量濃度約為1.0 g·L-1的對照品儲備液。
2.1.2 空白腸灌流液的製備 K-R液適量，按2.3項下方法灌流，收集流出液，即得。
2.1.3 含藥腸灌流液的製備 稱取葛根素原料藥200 mg，和不同比例的方中其他成分，加入10 mL pH 7.4的緩衝液於25 mL具塞試管中，按2010年版藥典凡例下溶解度的操作，每隔5 min強力振搖30 s；過濾後取續濾液用K-R液稀釋得葛根素質量濃度為80 mg·L-1的灌流液。
2.2 分析方法的建立
2.2.1 色譜條件 Luna C18色譜柱（4.6 mm × 250 mm，5 μm，Phenomenex，USA）；流速1.0 mL·min-1；檢測波長250 nm；柱溫30 ℃；進樣量20 μL；流動相：0.05%磷酸溶液-乙腈（82∶18）。
2.2.2 標準曲線繪製 精密移取2.1.1項對照品儲備液 0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0 mL，定容至5 mL得質量濃度為20，40，80，120，160，200 mg·L-1的係列對照品溶液，分別精密吸取各係列對照品溶液20 μL注入高效液相色譜儀，記錄峰麵積。以質量濃度為橫坐標，峰麵積為縱坐標進行線性回歸得其標準曲線y=113 923x-535 665，R2= 0.999 1。
2.2.3 精密度試驗 取對照品灌流液於1 d內HPLC重複測定6次考察日內精密度；取對照品灌流液，分別於第1，3，5天HPLC測定，考察日間精密度。日內精密度及日間精密度RSD均小於4%。
2.2.4 穩定性試驗 含藥灌流液於0，2，4，6，8，12 h不同時間點測定，計算峰麵積，RSD小於2%。
2.2.5 回收率考察 精密吸取高、中、低3個濃度含藥灌流液，每個濃度平行3份，各精密加入對照品灌流液，以測得濃度與實際濃度做比較計算方法回收率。方法回收率不低於80%。
2.3 大鼠在體腸單向灌流實驗
大鼠禁食不禁水18 h，稱重，10%水合氯醛麻醉。背位固定於實驗台上，沿腹中線剪開腹部3～4 cm，找到實驗用腸段（空腸段離幽門15 cm處開始），進口端與注射泵相連，用預熱至37 ℃的生理鹽水5 mL·min-1的速度對所取腸道進行衝洗。流速調為0.2 mL·min-1，開始灌流藥液，約30 min後吸收達到穩定狀態。開始計時，用已知質量的小瓶在出口處每隔15 min收集1次，計算收集前後小瓶質量稱量差，同時測定收集液的密度，以此方法來進行灌流液的體積校正。實驗結束後處死大鼠並剪下被灌流的腸段，測量其長度和內徑。HPLC測定不同時間段流出藥液中指標性成分。采用重量法校正水分吸收，按文獻計算有效滲透係數、腸吸收速率常數和腸吸收分數[11]。