鼠源性HSP70、GM—CSF雙修飾前列腺癌全細胞疫苗的建立與鑒定
論著
作者：馬琪 陳俊豐 蔣軍輝 王平 蔣照輝 程躍
[摘要] 目的 建立鼠源性HSP70、GM-CSF雙修飾前列腺癌全細胞疫苗。 方法 通過化學合成和PCR方法分別構建小鼠Hspa1a、Csf2基因片段，TA克隆入pMD-18T載體測序驗證。上述合成好的目的序列通過限製性內切酶BamHI/AscI酶切、T4DNA連接酶連接，分別裝入慢病毒表達載體pLenti6.3_MCS中，構建慢病毒重組載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_Csf2_V5。載有重組載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_Csf2_V5的慢病毒液分別對鼠前列腺癌細胞係RM-1進行穩定轉染或共轉染，Western blot檢測蛋白表達，10 Gy放射線照射使其喪失增殖能力後凍存。 結果 測序驗證重組慢病毒表達載體pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc和pLenti6.3_MCS_Csf2_V5構建成功。經293T細胞包裝後分別或共轉染RM-1，Western blot證實GM-CSF、sHSP70表達，GM-CSF和HSP70共表達。 結論 本實驗成功建立了鼠HSP70、GM-CSF雙修飾RM-1細胞全細胞疫苗，為以後進一步探討全細胞抗原作用機製和全細胞免疫增強機理奠定基礎。
[關鍵詞] 熱休克蛋白；巨噬細胞集落刺激因子；前列腺癌全細胞疫苗
[中圖分類號] R730.3；R735.9 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2015）19-0001-04
去勢抵抗性前列腺癌（castration resistant prostate cancer， CRPC）是當前前列腺癌診治中的熱點和難點。目前，利用免疫技術治療CRPC發展迅速，基於樹突狀細胞疫苗、全細胞腫瘤疫苗、細胞因子、抗體等多種方法在CRPC得到應用。其中樹突狀細胞疫苗APC 8015已於2010年通過FDA審批，並進入NCCN指南，成為前列腺癌免疫治療領域的重要進展之一[1]。而與樹突狀細胞疫苗同期進入Ⅲ期臨床試驗的全細胞疫苗GVAX則未獲通過。 本研究擬在前列腺癌全細胞疫苗GVAX基礎上，進一步利用熱休克蛋白70 （Hsp70）進行修飾，利用全細胞疫苗和熱休克蛋白疫苗在理論上所具有的良好協同機製，發展新型全細胞前列腺癌治療性疫苗，為以後進一步探討全細胞抗原作用機製和全細胞免疫增強機理奠定基礎，報道如下。
1 材料與方法
1.1 主要試劑與材料
鼠前列腺癌細胞係RM-1細胞株購自於中科院上海細胞庫，293T由本實驗室保存；pMD18-T 載體購自Takara公司；限製性內切酶BamHI和AscI，T4 DNA連接酶購自NEB公司；感受態細胞DH5α購自北京全式金公司；platinum Pfx DNA 聚合酶、Taq DNA 聚合酶、慢病毒載體pLenti6.3-MCS、包裝質粒混合物ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix、RPMI 1640培養基、DMEM培養基、胎牛血清、轉染試劑lipofectamine 2000、Opti-MEM 培養液、胰蛋白酶0.25% Trypsin-EDTA均購自life technologies公司；蛋白裂解液RIPA、蛋白酶抑製劑PMSF、標簽抗體兔抗鼠Myc均購自cell signaling 公司；標簽抗體兔抗鼠V5購自Abcam 公司；HRP標記羊抗兔二抗購自Santa Cruz公司；BCA蛋白測量試劑盒Thermo scientific公司；增強型化學發光檢測試劑盒購自Pierce公司。
1.2 方法
1.2.1 TA克隆 根據Genbank中 Hspa1a（NM-010479.2）和Csf2（NM-009969.4）的基因信息，對所需合成的目的序列進行分析，檢查基因內部有無特別複雜二級結構和重複序列連接。根據基因序列分析的結果，分別進行單鏈oligo的設計及化學合成。利用PCR將合成的oligo拚接成完整的基因序列（其中目的序列Hspa1a末端插入標簽蛋白cMyc基因序列，Csf2末端插入標簽蛋白V5基因序列）。將合成好的序列裝入pMD18-T載體並轉化至感受態細胞DH5a。測序驗證重組克隆中插入序列是否與要求相一致。本部分內容由上海英駿生物技術有限公司完成。
1.2.2 亞克隆 BamHI/AscI雙酶切TA克隆的目的片段，37℃酶切2 h，酶切體係為：10×buffer 5 μL，目的片段10 μL（約1 μg），BamHI 1μL，AscI 1 μL，ddH2O 23 μL。用BamHI/AscI把pLenti6.3_MCS進行酶切，37℃酶切2 h，酶切體係為：10×buffer 5 μL，pLenti6.3_MCS 2 μL（約1 μg），BamHI 1 μL，AscI 1 μL，ddH2O 41 μL。電泳，回收酶切的目的片段。T4 DNA連接酶連接回收的片段與載體，室溫連接2 h，連接體係如下：連接緩衝液1 μL，慢病毒載體1 μL，目的片段2 μL，T4 DNA連接酶0.5 μL，ddH2O 5.5 μL。取5 μL連接產物轉化感受態細胞DH5a。從轉化的平板上挑去多個陽性單克隆進行測序驗證。
1.2.3 慢病毒的包裝與病毒滴度測定 取細胞狀態良好，處於對數生長期的293T細胞，細胞計數後，按照每個10 cm的培養皿6×106個細胞數接種於培養皿中，37℃，5% CO2 的培養箱中培養過夜。第2天轉染前移去培養液，添加5 mL Opti-MEM培養液，取9 μg ViraPowerTM Lentiviral Packaging Mix和3 μg慢病毒表達質粒加入1.5 mL Opti-MEM（經37℃預熱）中輕輕混勻，取36 μL lipofectamine2000 加入1.5 mL Opti-MEM中輕輕混勻，室溫放置5 min；輕輕混合質粒溶液和lipofectamine 2000稀釋液，置室溫20 min。將3 mL質粒脂質體複合物小心地加入到細胞培養皿中，輕輕混勻，37℃，5% CO2的培養箱中孵育6 h後，更換完全培養液DMEM+10%FBS。48 h後收集細胞培養上清，3000 rpm 離心10 min，去除細胞和碎片，並用0.45 μm的濾器過濾。將病毒原液在50000 g下超速離心2 h，去除上清，重懸於DMEM培養液中，置於-80℃ 保存備用，並留少量慢病毒測定物理滴度。利用逐孔稀釋滴度測定法和熒光定量PCR法測定病毒滴度。標準品原液和病毒原液各10 μL分別進行1∶10梯度稀釋，如取10 μL的慢病毒原液用無菌水稀釋100 μL，作為Lv-1，取10 μL Lv-1，用無菌水稀釋至100 μL，設為Lv-2，取10 μL Lv-2，用無菌水稀釋至100 μL，設為Lv-3，共計6個濃度。將標準品和各稀釋度的慢病毒樣品，通過實時熒光定量PCR檢測，並計算各稀釋液中的病毒滴度，如果三個稀釋度的CT值均在標準曲線範圍內，可取其平均值。
1.2.4 慢病毒感染RM-1細胞 取對數生長的RM-1細胞，以2×105/孔接種於6孔板中，37℃，5% CO2的培養箱中培養，待細胞融合度達到30%～50%時，加入慢病毒感染液進行實驗。實驗分成5組，分別為CON組（空白對照組）、NC組（空病毒載體感染組）、pLenti6.3_ MCS_Hspa1a_cMyc病毒載體感染組、pLenti6.3_MCS_ CSf2_V5病毒載體感染組、pLenti6.3_MCS_Hspa1a_ cMyc/pLenti6.3_MCS_CSf2_V5病毒載體共感染組。預實驗明確pLenti6.3_MCS_Hspa1a_cMyc病毒載體感染組感染細胞的最佳感染複數（multiplicity of infection， MOI）值為8，pLenti6.3_MCS_CSf2_V5病毒載體感染組最佳MOI值為10。根據預實驗最佳MOI值，在RM-1細胞中加入適量病毒，12 h後觀察細胞狀態：如果沒有明顯的細胞毒性作用，繼續培養24 h後更換培養基；如果有明顯的細胞毒性作用，立即更換培養基。