第1向固相pH梯度等點聚焦（IEF）電泳：應用Ettan IPGphorⅡSystem，參照GE Healthcare公司雙向電泳實驗手冊進行操作。選用24 cm IPG膠條（pH 3～10，NL），蛋白樣品通過加入水化上樣緩衝液中上樣，考染上樣量分別為800，1 000，1 200 μg，加入樣品後的水化上樣緩衝液總體積為450 μL。設置等電聚焦電泳參數（30 V主動水化12 h，200 V Step and Hold 1 h，500 V Step and Hold 1 h，1 000 V Step and Hold 1 h，4 000 V Gradient 6 h，8 000 V Step and Hold 65 000 Vh，500 V Step and Hold保持任意時間）。等電聚焦結束後，於膠條平衡緩衝液I和II中各平衡15 min。
第2向SDS-PAGE電泳：將平衡好的膠條轉入預先灌製好的的聚丙烯酰胺凝膠上，使之與膠麵完全接觸，再加入低熔點瓊脂糖封膠液，排盡膠條與凝膠之間的氣泡。使用Ettan Daltsix Electrophoresis System進行第2向電泳，參數設置為10 mA·gel-1，待樣品完全走出膠條濃縮成一條線時，加大電流至40 mA·gel-1，直至溴酚藍前沿距離膠底部約0.5 cm處停止電泳，在相同條件下實驗重複3次。
凝膠染色、圖像采集及分析：電泳結束後取出凝膠，采用改良考馬斯亮藍染色法染色[7]，利用UMAX PowerLook 2100xl掃描儀透射掃描采集圖像，所獲圖像用PD Quest軟件進行分析。包括蛋白點檢測及人工編輯、量化、背景消減、標準化、相對分子質量和等電點的分析和匹配，並以模型組凝膠圖譜作為參考膠，篩選差異蛋白點，以蛋白表達水平相差2倍以上的為差異蛋白點[10]。
3 結果
3.1 腦組織大體觀察
TTC染色後，正常腦組織呈紅色，梗死腦組織呈白色。肉眼觀察可見假手術組紅染，未出現白色梗死灶；模型組大鼠左側腦組織缺血區出現明顯的白色梗死灶，範圍較大；藥物組大鼠大腦左側的白色梗死灶麵積較小。
A. 假手術組；B. 模型組；C. 藥物組。
3.2 腦組織病理形態學觀察
HE染色後，光鏡下假手術組大鼠腦組織結構緊密，神經細胞數目多，排列規整，形態良好。模型組大鼠非缺血側大腦組織結構同假手術組；缺血側腦組織細胞間隙明顯增寬，形態不規則，明顯水腫。藥物組非缺血側細胞形態結構與模型組非缺血側類似，細胞形態良好；缺血側腦組織細胞間隙增寬，細胞腫脹，細胞形態較模型組改善。
3.3 蛋白質量濃度測定
測定BSA蛋白在不同濃度時的吸收度（A）繪製標準曲線。假手術組、模型組和藥物組分別加入1，1，2 μL腦組織蛋白原液，測得A均值分別為0.562，0.557，0.671，代入蛋白質量濃度標準曲線方程y=0.015 4x + 0.376 3，計算得出假手術組、模型組和藥物組腦組織蛋白質量濃度分別為12.058，11.734，9.568 g·L-1。
3.4 2-DE結果
經2-DE及考馬斯亮藍染色後，得到2組腦組織的2-DE圖譜，並在相同條件下均將同一蛋白樣品重複實驗3次。應用PD Quest軟件檢測蛋白點，假手術組檢測到蛋白點502個，模型組515個，蛋白點主要位於相對分子質量25～100 kDa，等電點4～7處，2組之間凝膠的匹配率為70.2%～74.5%。2組蛋白點表達水平相差2倍以上的有87個。手工標記出45個差異明顯的的蛋白點。
3.5 上樣量改進和差異蛋白點分析
上樣量的控製也是2-DE 圖譜最終效果的影響因素之一，為獲得最佳的上樣量，對藥物組分別采用800，1 000，1 200 μg 3個上樣梯度進行電泳，發現對
於24 cm非線性pH 3～10的IPG膠條，大鼠腦蛋白上樣量為1 000 μg較適合。應用藥物連續幹預72 h後，與模型組比較，在上述發現的87個差異蛋白點中有34個蛋白點表達量出現明顯變化，其中有15個蛋白點表達量明顯升高，有17個蛋白點表達量明顯降低，有2個是新出現蛋白質點， 2組差異明顯的16個蛋白點的表達量、相對分子質量及等電點，改進上樣量後模型組和藥物組的2-DE圖譜，差異蛋白點的二維、三維（3D）。
4 討論
證候是對人體疾病變化過程中某一階段的病理狀態的綜合描述，反應疾病的一個“橫斷麵”，要想真正把握疾病的全過程，必須采用病證結合的模式[11]。大量臨床實踐發現[12-14]，急性缺血性腦卒中發病入院後3～5 d出現的火毒證是病情加重、惡化乃至死亡的重要標誌，在該特定時間窗內疾病的四診信息變化與微觀指標聯動，火毒證類的轉化迅速而劇烈，清熱解毒通絡中藥往往可以立起沉屙，挽救生命，改善體征，但具體作用機製尚未闡明。為進一步深入研究，前期本課題組建立了缺血性腦卒中火毒證的病證結合大鼠模型，並對大鼠表征、體溫、凝血指標、腦組織形態學等進行綜合評價，構建了該模型的評價體係。本研究在前期工作的基礎上，選用該模型，以具有清熱解毒通絡作用的代表藥苦碟子注射液進行幹預。
中藥苦碟子Ixeris sonchifolia Bge.Hance為菊科Compositae苦蕒菜屬植物抱莖苦蕒菜的當年生幹燥全草，具有清熱解毒、涼血活血、排膿止痛之功效。苦碟子注射液是由其提取精製而成，主要成分為黃酮類、腺嘌呤苷、倍半萜內酯類等，具有顯著的心腦血管治療作用，臨床上常用於治療腦梗死、冠心病及心絞痛等疾病[15-17]。本研究對模型大鼠腦組織的大體觀察和病理形態學觀察發現，藥物組大鼠大腦左側的白色梗死灶麵積較小，光鏡下細胞形態較模型組改善。本課題組前期的研究結果也發現苦碟子注射液具有一定的腦保護作用，且優於鹽酸法舒地爾注射液[4]。
近年來，隨著後基因時代的到來，蛋白質組學作為一種高通量篩選方法可以比較2個或更多樣品之間蛋白質整體表達水平，尋找具有統計學意義和豐度差異的蛋白點，為中藥複雜體係的研究提供了嶄新的思路和方法，非常適用於研究中藥複雜成分對疾病的作用機製，尋找有效的藥物靶標及中藥新藥研發[18-19]。雙向凝膠電泳是蛋白質組學研究中的關鍵核心技術之一，是目前分離複雜蛋白質組分最常用的工具[20]。本研究利用該技術首先通過對缺血性腦卒中火毒證大鼠腦組織差異表達蛋白2-DE圖譜的研究，尋找與疾病相關蛋白，得到模型組與假手術組有87個蛋白點表達水平相差2倍以上，並在確證中藥苦碟子注射液具有腦保護作用的基礎上，進一步觀察其對大鼠差異蛋白表達水平的影響，發現其中的34個蛋白點表達量出現明顯變化，表達量明顯升高的蛋白點為15個，表達量明顯降低的蛋白點為17個，新出現的蛋白質點有2個，列出了其中差異明顯的16個蛋白點的表達量、相對分子質量、等電點及三維示意圖。
根據蛋白質的相對分子質量、等電點及蛋白質來源等信息，利用蛋白質數據庫並結合參考文獻中的腦皮質2D-PAGE圖譜，對部分差異蛋白質點進行初步推測，可能包含熱休克蛋白（heat shock proteins，Hsps），14-3-3蛋白（14-3-3proteins），果糖二磷酸醛縮酶C（fructose-bisphosphate aldolase C， AldC）。Hsps是細胞在受到缺血、缺氧、高溫等刺激時觸發自身免疫反應係統產生的一組非分泌性應激蛋白質，根據相對分子質量大小分為HSP70，HSP90 和小分子量家族。近年研究發現，Hsps對於腦血管疾病的治療和臨床檢測有很大潛力，其中Hsp70的表達與缺血半影區神經元的保護密切相關[21]。14-3-3蛋白家族是一種可溶性的酸性異源二聚蛋白，在哺乳動物中存在β，ε，γ，η，θ（τ），ζ，σ7種亞型，其中β，ε，γ，η，ζ主要分布在大腦皮質神經細胞內。在腦缺血性疾病中，神經元損傷後細胞溶菌作用會導致14-3-3蛋白水平增加，進而可能參與星形膠質細胞增生[22-23]。AldC是存在腦、心髒等組織中的一種糖酵解同工酶[24]，研究發現AldC可能與腦卒中後半影區電生理變化的發病機製相關[25]。