2.2.2 對照品溶液的製備 精密稱定歐前胡素4.90 mg，置於20 mL棕色量瓶中，色譜純甲醇溶解，稀釋至刻度搖勻，製備成質量濃度為0.245 g·L-1的對照品溶液。
2.2.3 供試品溶液的製備 精密稱取1 g白芷藥材粉末（過80目篩）於100 mL燒瓶中，加入70%乙醇50 mL，稱重，水浴加熱回流提取2 h，冷卻後補重，過濾，取續濾液。精密量取5 mL續濾液，減壓回收溶劑至幹，用色譜純甲醇定容至5 mL，過0.22 μm微孔濾膜，供HPLC分析。
2.2.4 樣品的含量測定與含量分布 精密吸取對照品溶液、供試品溶液各10 μL，分別按2.2.1項方法進行測定，計算得到30個樣品的歐前胡素質量分數為0.066%～0.257%。其中，質量分數0.100%～0.199%的樣品達到樣品總數的60%[16]，該含量分布情況有利於準確建立定量模型。
A.對照品溶液； B.供試品溶液： 1.歐前胡素。
2.3 定性鑒別方法
用於定性鑒別的58個樣品的NIR光譜原始譜圖經21點平滑後進行一階導數求導，采用矢量歸一化法進行預處理，在8 806.0～3 811.0 cm-1的光譜區段內提取樣品的光譜信息。采用OPUS軟件中的標準法，依據歐式距離公式計算譜圖與譜圖之間的距離，根據計算的距離大小，通過OPUS/INDENT定性分析軟件中的Ward′s Algorithm法進行聚類分析。
歐式距離公式為Dij=∑ K（Aik-Ajk）2，其中，Aik和Ajk分別為i光譜和j光譜在波長點k處的吸光度。
Ward′s Algorithm法是從方差分析的角度出發，要求分類的結果是類內方差盡量小，類間方差盡量大。
2.4 建立歐前胡素定量模型的方法
采用交叉驗證法，對2.2.4中進行含量測定的30個樣品按照歐前胡素含量大小排序，均勻選擇22個樣品作為校正集，剩下的8個樣品作為驗證集。並使校正集的含量範圍大於驗證集[17]。將校正集和驗證集的NIR光譜與HPLC分析值相關聯，采用OPUS/QUANT定量分析軟件中的偏最小二乘法建立歐前胡素含量的定量模型。同時，以校正模型相關係數（R2）、內部交叉驗證均方差（RMSECV）和預測均方差（RMSEP）作為模型性能的評價指標。
3 結果與討論
3.1 硫磺熏蒸白芷與非硫磺熏蒸白芷的定性鑒別
3.1.1 光譜預處理及波長範圍選擇 為消除對光譜的各種幹擾因素，如高頻隨機噪音、基線漂移、信號本底、樣品不均勻與光散射等，對光譜采用一階導數+矢量歸一化法進項預處理。NIR光譜的主要吸收區域為含氫的各級倍頻和合頻帶。12 500.0～9 000.0 cm-1為二級倍頻區，此區域譜線漂移嚴重，強度較弱，為末端效應，係統誤差也會使光譜曲線在末端產生較大噪音，一般不作分析區域[18]。從白芷的近紅外光譜可以看出，12 500.0～8 806.0 cm-1區段平滑，圖譜信息量較少。8 806.0～5 000.0 cm-1區段具有比較豐富的信息，而5 000.0～3 811.0 cm-1區段的信息尤為豐富。為了獲得比較全麵的圖譜信息，避免高頻隨機噪音、基線漂移、信號本底、樣品不均勻與光散射等對光譜的各種幹擾，選取8 806.0～3 811.0 cm-1的光譜區段作為近紅外光譜分析的波數範圍，分析結果準確可靠。
3.1.2 聚類分析 分別將原始光譜圖按照無任何預處理、21點平滑後進行一階導數求導、21點平滑後進行二階導數求導、矢量歸一化法、21點平滑後一階導數求導+矢量歸一化法、21點平滑後二階導數求導+矢量歸一化法的方法進行預處理，在8 806.0～3 811.0 cm-1由Ward′s Algorithm法得到的聚類分析結果顯示，21點平滑後一階導數求導+矢量歸一化法和矢量歸一化法均能將硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸的白芷明顯聚為2類。但是，在光譜信息更為豐富的6 955.0～3 857.0 cm-1區段，單純的矢量歸一化法不能有效地聚為2類，而21點平滑後一階導數求導+矢量歸一化法則能將硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸白芷聚為2類。8 806.0～3 811.0 cm-1區段的NIR圖譜經21點平滑後一階導數求導+矢量歸一化法的聚類。硫磺熏蒸和非硫磺熏蒸的白芷可明顯聚為2類，說明采用NIR光譜技術可以快速、無損地完成硫磺熏蒸白芷和非硫磺熏蒸白芷之間的定性鑒別。曾有文獻報道[3-4]，白芷經硫磺熏蒸後，香豆素類成分的總含量下降了60%～80%。因此，可以認為，NIR聚類分析結果的不同，根本的原因在於硫磺熏蒸對其中化學成分含量的變化，說明NIR的聚類分析結果與化學成分的變化結果具有一致性。
3.2 白芷中歐前胡素定量模型的建立
3.2.1 光譜預處理 由於樣品的物理性質，如樣品顏色、顆粒大小等會影響NIR光譜基線的漂移和斜率的變化，對校正模型的建立產生較大的影響，因此對光譜進行預處理是必要的。本實驗以校正模型相關係數（R2）、內部交叉驗證均方差（RMSECV）和預測均方差（RMSEP）作為模型性能的評價指標。其中，R2越接近1，RMSECV越小說明樣品化學值與近紅外預測值相關性越好，且校正模型的結構越合理；RMSEP越小說明模型的預測和推廣性能越好。本實驗采用不同的預處理方法進行比較。從中確定具有最優值的最佳預處理方法為一階導數+減去一條直線法，建模波數為6 102.2～5 446.3 cm-1。