鬼針草化學成分研究
化學
作者：王曉宇 陳冠儒 鄧子雲 趙傑 葛金芳 李寧 陳飛虎
[收稿日期] 2013-10-17
[基金項目] 國家“重大新藥創製”科技重大專項（2009ZX0912-386）
[通信作者] *陳飛虎，Tel：（0551）65161116，E-mail；*李寧，Tel：（0551）65161115，E-mail
[作者簡介] 王曉宇，碩士研究生，Tel：13739250818，E-mail
[摘要] 對鬼針草Bidens bipinnata中的化學成分進行研究，篩選具有抗肝纖維化活性單體。采用大孔樹脂、矽膠、MCI樹脂、Sephadex LH-20等方法進行分離純化，得到15個化合物，並運用波譜技術測試，鑒定其結構為槲皮素（1），槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷（2），紫雲英苷（3），山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷（4），5，3′-二羥基-3，6，4′-三甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷黃酮（5），7，8，3′，4′-四羥基二氫黃酮（6），（R/S）-異奧卡寧-7-O-β-D-葡萄糖苷（7），（R/S）-異奧卡寧-3′-甲氧基-7-O-β-D-葡萄糖苷（8），6，7，3′，4′-四羥基橙酮（9），海生菊苷（10），6，7-二羥基香豆素（11），3-咖啡酸酰基-2-甲基-D-赤蘚糖酸-1，4內酯（12），（7S，8R）苯並二氫呋喃新木脂素-4-O-β-D-葡萄糖苷（13），丁香酚-O-β-D-呋喃芹糖-（1″-6′）-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（14），（+）丁香脂素-4-O-β-D-吡喃葡萄糖苷（15）。其中化合物8，13～15為首次從本屬植物中分離得到。在初步的活性篩選中化合物1，6有較強體外抑製肝星狀細胞增殖的能力；化合物1，2，6，7有較強體外抑製腹腔巨噬細胞分泌炎症因子的能力。
[關鍵詞] 鬼針草；化學成分；抗肝纖維化；肝星狀細胞；巨噬細胞
鬼針草Bidens bipinnata L.是菊科鬼針草屬一年生草本植物，在我國大部分地區均有分布。民間藥用曆史悠久，具有有清熱解毒、涼血止血、散瘀、消腫等功效，主治感冒發熱、咽喉腫痛、肝炎及蛇蟲咬傷等。目前，各國學者對鬼針草屬植物的化學成分進行廣泛研究，其中主要包括黃酮類，聚乙炔類等成分。此外，本課題組前期藥理學研究也表明，鬼針草具有抗肝纖維化的功效，其總黃酮提取物對於小鼠肝損傷以及大鼠肝纖維化均有保護作用[1-3]。為了更大程度的利用鬼針草藥材，得到具有抗肝纖維化活性的具體成分，本實驗對鬼針草總黃酮提取物化學成分進行係統分離，並且將得到的化合物進行體外抗肝星狀細胞增殖以及抑製腹腔巨噬細胞生成腫瘤壞死因子TNF-α和 IL-1的活性研究，為進一步開發利用鬼針草提供依據。
1 材料
AM-400，DRX-500型核磁共振光譜儀（瑞士Bruker公司，四甲基矽烷作為內標）；Agilent 1260-6224液質聯用儀（美國安捷倫公司）；HPD 100大孔樹脂（河北寶恩公司）；Sephadex LH-20（瑞典GE Healthcare Bio-Sciences公司）；MCI（日本Mitsubishi Chemical公司）；柱色譜矽膠（青島海洋化工廠）；薄層色譜GF254矽膠板（煙台江友矽膠開發有限公司）；肝星狀細胞HSC-T6（中南大學湘雅醫學院）；小鼠單核巨噬細胞係RAW264.7（中國科學院上海細胞研究所）；LPS（美國Sigma）；Elisa試劑盒（美國R&D公司）；DMEM和FBS（美國Hyclone）。鬼針草采集於安徽省績溪縣，經安徽醫科大學藥學院中藥學教研室張群林教授鑒定，屬於菊科鬼針草屬鬼針草B. bpinnata，標本號為JX053。
2 方法
2.1 提取分離 55 kg鬼針草幹燥全草，用70%乙醇提取2次，提取液蒸發至無醇味，過HPD 100大孔樹脂，分別用3倍柱體積雙蒸水和70%乙醇作為洗脫劑，收集70%乙醇洗脫部分，蒸幹，得到浸膏1.8 kg。浸膏用水分散，再次過HPD 100大孔樹脂，采用10%～100%乙醇進行洗脫，共得到5個部分，B1～B5。B3（280 g）部分用矽膠柱色譜（氯仿-甲醇 10∶1～1∶1）梯度洗脫得到7個部分，B3-1～B3-7。B3-1 經過Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脫、矽膠色譜（石油醚-乙酸乙酯 5∶1～1∶1）梯度洗脫得到化合物11（6 mg），12（10 mg）。B3-2經過Sephadex LH-20（0～100%甲醇）梯度洗脫得到B3-2-1～B3-2-6；B3-2-1采用Sephadex LH-20（100%乙醇）得到化合物6（55 mg）；B3-2-6經過MCI（30%～100%甲醇）得到化合物15（54 mg）。B3-4經過Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脫得到B3-4-1和B3-4-8；B3-4-1采用矽膠柱色譜（氯仿-甲醇 5∶1～1∶1）分離純化，得到化合物8（10 mg），13（25 mg）；B3-4-5 采用矽膠柱色譜（石油醚-乙酸乙酯 5∶1～1∶5）進行梯度洗脫得到化合物4（8 mg）。B3-6采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脫得到B3-6-1～B3-6-7；B3-6-1采用凝膠（100%乙醇）純化得到化合物14（100 mg）；B3-6-2和B3-6-7均采用MCI（0～100%甲醇）分別得到化合物7（27 mg），9（23 mg）。B3-6-4采用MCI（0～100%甲醇）以及反複的矽膠柱色譜（氯仿-甲醇 20∶1～4∶1）純化得到化合物2（25 mg）。B3-7采用矽膠柱色譜（氯仿-甲醇 20∶1～1∶1）得到B3-7-1～B3-7-10；B3-7-1采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）梯度洗脫得到化合物1（45 mg）；B3-7-3先後采用Sephadex LH-20（0%～100%甲醇）以及MCI（30%～100%甲醇）得到化合物3（20 mg），5（17 mg），10（23 mg）。
2.2 四甲基偶氮唑法（MTT） HSC-T6細胞培養於10% FBS的DMEM培養基。取對數生長期的細胞（5×103細胞/孔）接種於96孔板中，待細胞貼壁加入不同濃度化合物（200，100，50，25，12.5 μmol·L-1），每個劑量設5個複孔，培養48 h後棄去上清。每孔加入20 μL濃度為5 g·L-1的MTT和180 mL無血清培養基，繼續培養4 h後棄上清。加入150 mL的DMSO，震蕩後用酶標儀在波長490 nm測吸光度，重複3次。
2.3 IL-1和TNF-α含量測定 RAW264.7細胞培養於10% FBS的DMEM培養基中。取對數生長期的細胞（1×105細胞/孔）接種於24孔板中，培育養2 h後用分別加入LPS（1 mg·L-1）和不同濃度化合物（100，10，1 μmol·L-1）繼續培養24 h。收集培養液的上清液於4 ℃，3 000 r·min-1離心10 min，-20 ℃保存待測。IL-1和TNF-α含量測定按ELISA試劑盒給定的步驟進行操作。
3 結構鑒定
化合物1 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 301.034 5[M-H]-（C15H9O7，計算值301.035 4）； 1H-NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：7.82（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.69（1H，dd，J=8.5，1.8 Hz，H-6′），6.99（1H，d，J=8.5 Hz，H-5′），6.52（1H，d，J=1.6 Hz，H-8），6.26（1H，d，J=1.6 Hz，H-6）； 13C-NMR（CD3COCD3，100 MHz）δ：146.9（C-2），136.7（C-3），176.5（C-4），157.8（C-5），99.2（C-6），165.1（C-7），94.5（C-8），162.3（C-9），104.1（C-10），123.7（C-1′），115.8（C-2′），145.9（C-3′），148.4（C-4′），116.3（C-5′），121.5（C-6′）。以上數據與文獻[4]報道槲皮素的數據基本一致。
化合物2 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 471.089 7[M+Na]+ （C21H20NaO11，計算值471.089 8）； 1H-NMR（CD3OD，400 MHz）δ：7.33（1H，d，J=1.8 Hz，H-2′），7.30（1H，dd，J=8.3，1.9 Hz，H-6′），6.91（1H，d，J=8.3 Hz，H-5′），6.36（1H，d，J=1.9 Hz，H-8），6.19（1H，d，J=1.9 Hz，H-6），5.35（1H，br s，H-1″），4.22～3.69（4H，m，H-2″～5″），0.93（3H，d，J=6.6 Hz，H-6″）。以上數據數據與文獻[5]報道槲皮素-3-O-α-L-鼠李糖苷的數據基本一致。
化合物3 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 471.089 7[M+Na]+（C21H20NaO11，計算值471.089 8）； 1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：8.04（2H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），6.88（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.43（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.20（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.46（1H，d，J=7.3 Hz，H-1″），3.57（1H，d，J=11.4 Hz，H-6″a），3.33（1H，m，H-6″b），3.41～3.09（4H，m，H-2″～5″）。以上數據與文獻[6]報道紫雲英苷的數據基本一致。
化合物4 淡黃色粉末；HR-ESI-TOF-MS m/z 455.094 9[M+Na]+（C21H20NaO10，計算值471.094 9）； 1H-NMR（CD3COCD3，400 MHz）δ：7.86（2 H，d，J=8.8 Hz，H-2′，6′），7.02（2H，d，J=8.8 Hz，H-3′，5′），6.47（1H，d，J=2.0 Hz，H-8），6.27（1H，d，J=2.0 Hz，H-6），5.54（1H，d，J=1.2 Hz，H-1″），4.22～2.20（4H，m，rha-H），0.90（3H，d，J=5.7 Hz，6″-CH3）； 13C-NMR（CD3COCD3，100 MHz）δ：158.0（C-2），135.7（C-3），179.3（C-4），163.2（C-5），99.6（C-6），165.0（C-7），94.6（C-8），160.9（C-9），105.8（C-10），122.6（C-1′），131.7（C-2′，6′），116.3（C-3′，5′），158.5（C-4′），102.7（C-1″），71.5（C-2″），72.2（C-3″），73.0（C-4″），71.4（C-5″），17.8（C-6″）。以上數據與文獻[7]報道山柰酚-3-O-α-L-鼠李糖苷的數據基本一致。
化合物5 黃色粉末；1H-NMR（DMSO-d6，400 MHz）δ：7.55（1H，d，J=7.4，2.0 Hz，H-6′），7.54（1H，d，J=2.0 Hz，H-2′），7.08（1H，d，J=7.4 Hz，H-5′），6.95（1H，s，H-8），5.13（1H，d，J=7.12 Hz，H-1″），3.86（3H，s，4′-OMe），3.80（3H，s，3-OMe），3.77（3H，s，6-OMe），3.74（1H，m，H-6″a），3.51（1H，m，H-6″b），3.49（1H，m，H-5″），3.36（2H，m，H-2″，3″），3.23（1H，m，H-4″）； 13C-NMR（DMSO-d6，100 MHz）δ：178.6（C-4），156.7（C-2），156.2（C-7），152.3（C-5），151.5（C-9），150.6（C-4′），146.5（C-3′），138.2（C-3），132.4（C-6），122.4（C-1′），120.8（C-6′），115.3（C-2′），112.0（C-5′），106.5（C-10），100.3（C-1″），94.3（C-8），77.4（C-3″），76.9（C-5″），73.4（C-2″），69.8（C-4″），60.9（C-6″），60.6（4′-OMe），60.0（3-OMe），55.9（6-OMe）。以上數據與文獻[8]報道5，3′-二羥基-3，6，4′-三甲氧基-7-O-β-D-吡喃葡萄糖苷黃酮數據基本一致。