3.2.1 鐵皮石斛中具有轉錄活性的Ty1-copia類RT核苷酸序列比較 將獲得的42條具有轉錄活性的反轉錄轉座子反轉錄酶的保守序列於NCBI數據庫進行序列比對，結果表明它們均與已知植物Ty1-copia類反轉錄轉座子的RT序列有很高的相似性，序列大小為247～266 bp（表1），這與基因組Ty1-copia類反轉錄轉座子的RT序列基本一致[16]。所有序列均富含AT堿基，利用MEGA5.0 軟件計算出所有序列AT/GC比值為1.12～1.89；通過DNAMAN軟件計算出核苷酸序列同源性為46.3%～98.9%，其中序列C15-ABA-4與C15-ABA-5，C15-ABA-15，C15-ABA-32的同源性最高，均為98.9%，序列C15-ABA-19與C15-ABA-25的同源性最低，僅為46.3%。說明鐵皮石斛基因組中可能有多個Ty1-copia類反轉錄轉座子家族的轉錄活性能被ABA誘導。
利用軟件plantCARE分析，發現獲得的經ABA誘導後有轉錄活性的42條鐵皮石斛Tyl-copia RT序列中與基因組獲得的Tyl-copia RT序列一樣，存在多個受脅迫條件作用的調控元件、多個啟動子的特征結構TATA box和CAAT box的保守序列及其他一些調控元件；但與基因組獲得的Tyl-copia RT序列的區別是：在有轉錄活性的鐵皮石斛Tyl-copia RT序列中與脅迫條件作用相關的調控元件明顯增加，其中含有抵禦和脅迫順式調控元件的序列條數所占比例由基因組中的4.76%增加到45.24%，這充分說明ABA可以激活鐵皮石斛中一些含與脅迫相關調控元件的Tyl-copia類反轉錄轉座子。
3.2.2 鐵皮石斛中具有轉錄活性的Ty1-copia類RT氨基酸序列比較 將克隆得到的具有轉錄活性的42條序列翻譯成氨基酸，參照Ty1-copia類反轉錄轉座子RT基因的氨基酸保守序列，發現有19條序列發生了移碼突變，15條序列發生了終止密碼子突變，其中C15-ABA-25和C15-ABA-9分別發生了多達8個和9個終止密碼子的突變。由此推斷，移碼突變和終止密碼子突變可能是導致鐵皮石斛反轉錄轉座子異質性的重要原因之一。保守片段“SLYGKQ”[17]（第35個氨基酸開始）都發生了變異，其中有38條存在堿基替代突變，另外4條（C15-ABA-2，C15-ABA-14，C15-ABA-33，C15-ABA-42）均因在保守片段之前發生移碼突變而發生變異，僅有1條序列（C15-ABA-27）存在缺失突變。
由上可知，由ABA誘導的具有轉錄活性的Tyl-copia類反轉錄轉座子RT序列與基因組獲得該序列性質相似，異質性強，部分序列中存在終止密碼子、移框、缺失及堿基替代等突變。
應用軟件ClustaIX對序列進行比對，4種不同程度的陰影部分表示序列的保守程度；黑色部分保守性為100%；深灰色部分保守性為75%；淺灰色部分保守性為50%；沒有陰形部分保守性為小於50%；X.終止密碼子；·為優化聯配產生的缺口，右邊的數字表示序列中氨基酸的數量。
3.3 鐵皮石斛Ty1組反轉錄轉座子RT序列的係統發育進化樹分析
3.3.1 鐵皮石斛中發生轉錄的Ty1組反轉錄轉座子RT序列的係統發育進化樹分析 利用MEGA 5.0軟件鄰接法將所得的鐵皮石斛具有轉錄活性的42條Ty1-copia類反轉錄轉座子RT氨基酸序列構建相應的係統發育進化樹，樹的分枝來源於1 000個重複的自展率，根據進化樹branch的長度可把這42條具有轉錄活性的RT序列分成5類。其中Ⅰ類包含21個序列，Ⅱ類包含13個序列，Ⅲ類包含2個序列，Ⅳ類包含2個序列，Ⅴ類包含 4個序列。
3.3.2 鐵皮石斛中cDNA Ty1-copia RT序列和基因組DNA Ty1-copia RT序列的係統進化樹分析 將所得的42條鐵皮石斛C15中分離出的具有轉錄活性的Ty1-copia類反轉錄轉座子RT序列與基因組分離得到的21條氨基酸序列通過MEGA5.0進化分析軟件進行係統進化分析，得到Neighbor-joining係統發育樹進化樹，樹的分枝來源於1 000個重複的自展率。發生轉錄的Tyl組反轉錄轉座子RT序列 Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ類與基因組Tyl組反轉錄轉座子RT序列親緣關係較遠，第Ⅱ類與基因組中的C15-1聚為一類，第Ⅰ類與基因組中除C15-1以外的其他序列均聚在一起。說明經ABA誘導後發生轉錄的Tyl組反轉錄轉座子RT序列與基因組Tyl組反轉錄轉座子RT序列有很大的差異。
4 結論與討論
植物體防禦機製的產生主要依賴於植物感受刺激、產生及傳遞信號，最終引起生化改變及對新陳代謝的調整。在整個信號傳遞過程中，脫落酸（ABA）作為一種重要的調控因子，它在植物遭受生物和非生物脅迫的調控中起著關鍵作用。當植物受到各種
樹的分支程度根據1 000次重複的自展率，樹枝長度代表以鄰接法估算出來的遺傳距離。
環境脅迫如：幹旱、高鹽和寒冷等時，其體內會迅速合成和積累ABA，且隨著脅迫的消失而逐步恢複到原有的低水平[18-21]。研究表明，ABA能誘導大量基因的表達，在擬南芥中己經鑒定出1 300多種基因受ABA調節，其中一半表現為ABA抑製表達[22]。
Tyl-copia類反轉錄轉座子是DNA-RNA-DNA的轉座元件，轉錄是其轉座活性表達的必要步驟，在其LTRs中存在著轉錄起始與終止的信號以及與誘導表達相關的調控元件[23]。逆境脅迫能激活逆轉座子的活性，可能與植物的防禦機製有一定關係[24]。 逆轉座子在一定條件下被激活並發生轉座，也是逆轉座子對寄主基因組的一種適應，通過進化獲得和寄主相關環境誘導基因的啟動子相似的啟動子，從而能夠在脅迫條件下發生轉座[25]。
3種反轉錄轉座子LTR的U3區序列不同（其餘序列基本一致），在煙草Tnt1的LTR U3區含有調控該反轉錄轉座子表達的順式調控元件。其中，Tnt1C的轉錄活性能被水楊酸和植物生長激素誘導。本試驗中，鐵皮石斛種質C15經ABA誘導後檢測到了Ty1-copia類反轉錄轉座子的轉錄活性明顯增強，這是否表明鐵皮石斛反轉錄轉座子的表達與其防禦反應也有一定聯係，有待進一步試驗證明。反轉錄轉座子與寄主在長期進化過程中都形成了一套有利於自身生存與繁衍的機製。反轉錄轉座子會采取各種方式促進其轉座行為的發生，在本試驗中分離得到的鐵皮石斛基因組內具有轉錄活性的42條Ty1-copia類反轉錄轉座子反轉錄酶保守序列的變異性較大，其中23條序列具有移碼突變、終止子，1條存在缺失突變，但這些變異並不影響其轉錄活性，甚至有可能不影響其轉座的活性。這在其他生物體內也發現過類似情況[26-29]。比較極端的例子是玉米基因組內的LTR-反轉錄轉座子BSI，BSI缺失了反轉錄轉座子進行轉座所必須的組成成分-反轉錄酶基因，但其仍可借助其他反轉錄轉座子的相應功能進行轉座[26]。此外，反轉錄轉座子盡力“模仿”脅迫條件下寄主基因的調控表達模式也是促進其自身繁殖的手段之一。
對42條具有轉錄活性的鐵皮石斛Ty1-copia類反轉錄轉座子RT序列的係統聚類分析可分為5類，不同類別的反轉錄酶序列數量不同，反映了不同家族反轉錄轉座子的轉錄過程存在差異，其存在的曆史地位也可能不同[30]，對鐵皮石斛基因組進化的作用也可能各異。經與基因組反轉錄酶的氨基酸比較分析，具有轉錄活性的鐵皮石斛Ty1-copia類反轉錄酶序列中Ⅲ，Ⅳ，Ⅴ類仍然分別自成一枝，第Ⅱ類與基因組中的C15-1聚為一類，第Ⅰ類與基因組中除C15-1以外的其他序列均聚在一起。試驗結果不僅為研究鐵皮石斛研究非生物因素誘導與轉座子活性之間的關係提供了一個新的切入點，而且為進一步深入研究反轉錄轉座子在鐵皮石斛逆境反應機製中的作用創造了新的契機。
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