人參內生細菌NJ13在宿主體內定殖特性及對人參黑斑病的防治效果
資源與鑒定
作者：陳長卿 李桐 李欣蓮 薑雲 田磊 許鵬
[收稿日期] 2013-10-22
[基金項目] 吉林省科技廳重點科技攻關項目（20140204055NY）；國家大學生創新創業訓練計劃項目（201310193001）
[通信作者] *陳長卿，副教授，研究方向為藥用植物病害生物防治，E-mail
[摘要] 為明確人參內生生防細菌NJ13在宿主體內的定殖特性，該研究通過抗生素誘導獲得了同時對利福平和硫酸鏈黴素具有穩定抗性的雙抗標記菌株NJ13-R，分析了菌株在宿主體內的定殖特性，並研究了NJ13對人參黑斑病的田間防治效果。結果表明，菌株在人參根、莖、葉部均可定殖，而且定殖量與接種濃度呈正相關。菌株可在人參不同部位侵染植株並在體內進行轉移，在根部和葉部定殖量表現為先升後降的變化趨勢，而在莖部呈先升高後平緩趨勢。研究還發現，生防細菌NJ13表現出對宿主特定部位具有一定的偏好性，隨著時間推移在莖部的定殖量高於其他部位。田間試驗證明，生防細菌NJ13對人參黑斑病具有較好的防治作用，其中0.76×108 cfu·mL-1發酵液防效達75.62%，高於對照藥劑0.67 mg·L-1 50%嘧菌環胺WG的防效（73.06%）。
[關鍵詞] 內生細菌； 定殖； 人參黑斑病； 生物防治
人參Panax ginseng CA Mey為五加科人參屬多年生宿根草本植物，是我國傳統的名貴中草藥，素有“百草之王”的美譽，主要分布在我國東北長白山地區。由鏈格孢菌Alternaria panax Whetz.引起的人參黑斑病，是人參生產上發生最為普遍、分布最為廣泛、為害最為嚴重的病害之一。該病害主要為害人參地上部，包括葉片、莖稈、花梗和果實等部位，尤以葉斑和莖斑發生最為普遍，吉林省高發期集中在7—8月份，常年發病率在20%～30%，嚴重時可達80～100%，造成早期落葉、植株枯萎、不結實，參根和參籽減產，品質下降[1]。目前，生產上人參黑斑病主要以化學防治為主，然而在病害防治過程中化學農藥的不科學使用，暴露出了人參農藥殘留超標、出口率降低、病原菌抗藥性產生以及汙染生態環境等係列問題。因此，生物防治等更為安全有效的防治措施研究亟待開展。
目前國內外關於人參黑斑病生物防治的研究報道相對較少，主要集中在生防菌的分離篩選及發酵條件研究。崔立萍等[2]從土壤和人參黑斑病菌組織中分離篩選出對人參黑斑病菌有拮抗作用的菌株22個。李勇等[3]從人參根中分離出40株內生細菌，通過對峙培養篩選獲得了對人參黑斑病菌有抑製作用的內生細菌Stenotrophomonas maltophilia和Bacillus sp.。周如軍等[4-5]從人參根際土壤中篩選到對人參鏽腐病菌有拮抗活性的細菌2株和真菌1株，其對人參黑斑病菌有一定的抑菌效果，並對上述菌株進行了鑒定及最適發酵條件研究。
生防菌在植物體內的有效定殖是其控製植物病害的關鍵，因此，明確生防菌的定殖特性是揭示其生防機製和評價其應用潛力的重要依據。而目前關於人參內生菌的定殖及人參黑斑病田間生物防治研究還未見報道。本課題組從人參莖部分離獲得了1株對人參主要病害病原菌具有較好抑菌活性的內生細菌菌株NJ13，經鑒定為甲基營養型芽孢杆菌Bacillus methylotrophicus，明確了最適發酵培養條件[6]。為進一步挖掘NJ13菌株的生防潛力，本研究擬對菌株在人參體內的定殖特性及其對人參黑斑病的田間防治效果進行分析，為開展該菌株更為廣泛的生物防治及相關研究奠定堅實的基礎。
1 材料
1.1 供試菌株及培養基 供試生防菌株NJ13 B. methylotrophicus，由本課題組分離獲得；人參黑斑病菌A. panax由吉林農業大學植物病理實驗室提供。
NJ13按常規方法在NA（牛肉膏蛋白腖培養基）上繁殖保存，其發酵培養基為葡萄糖3%、可溶性澱粉1.5%，酵母浸粉1.5%，K2HPO4 0.1%，NaCl 0.5%，起始pH 8.0；靶標菌在常規PDA（馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養基）上繁殖保存。
1.2 試驗藥劑 利福平（rifampicin， Rif）和硫酸鏈黴素（streptomycin sulfate， Stre），購於北京鼎國生物技術有限公司，分別使用甲醇和無菌水溶解。50%嘧菌環胺WG購於先正達中國投資有限公司。
2 方法
2.1 NJ13菌株發酵液的製備 將NJ13菌株劃線接種於NA平板培養基上，28 ℃培養2 d。待菌落長好後用直徑1 cm的打孔器打取2塊菌碟，接種於滅菌的LB培養液（胰蛋白腖10 g，酵母浸粉5 g，NaCl 10 g，蒸餾水1 L，pH 7.4）中培養10 h，製備成發酵種子液，4%的接種量接入發酵培養基中培養，起始pH 8.0、搖瓶（250 mL）裝量75 mL/瓶，轉速為180 r·min-1，28 ℃搖瓶培養96 h得培養液。
2.2 NJ13對人參黑斑病菌的抑製作用 采用平板對峙法[7]測定NJ13菌體對人參黑斑病菌的抑製作用，取培養7～10 d的人參黑斑病菌平板，用直徑8 mm的打孔器在菌落邊緣打下菌碟，置於PDA平板一側，另一側放入8 mm的細菌菌碟，25 ℃培養5～7 d，測定抑菌帶大小。
采用混菌法[7]測定NJ13代謝物對人參黑斑病菌的抑製作用，①對將1 mL無菌水加入人參黑斑病菌的培養試管中，用接種針將菌絲和孢子刮下製成菌懸液與PDA培養基10 mL 混勻後到入直徑9 cm的培養皿中製成平板。②將NJ13發酵液12 000 r·min-1離心30 min，取上清液，然後用0.22 μm的滅菌細菌過濾器除菌得無菌培養濾液備用。③將無菌牛津杯置於充分冷卻後的平板中央，向牛津杯中加入200 μL無菌發酵液，25 ℃培養5～7 d，十字交叉法測定抑菌圈直徑。
2.3 NJ13抗生素標記菌株的篩選及生物學特性 參考文才藝等[8]方法加以改動，逐步提高培養基中抗生素濃度對生防菌株NJ13進行抗性誘導，獲得同時抗利福平和鏈黴素2種抗生素的雙抗菌株。在NA培養基冷卻至約50 ℃時加入配製好的利福平溶液，製成含利福平40 mg·L-1的平板培養基，將NJ13原始菌株塗布於抗生素平板上，28 ℃培養2～4 d，觀察到有菌落長出後，選取生長旺盛的單菌落，轉接到含利福平80 mg·L-1的平板上，依次挑選菌體生長情況良好和菌落形態和原始菌落形態相同的抗性突變株，按照同樣的方法逐步提高抗生素含量，獲得利福平標記菌株NJ13-rif。在此基礎上，用同樣的方法誘導利福平標記菌株產生對硫酸鏈黴素的抗性，起始抗生素質量濃度為50 mg·L-1，逐步提高硫酸鏈黴素濃度，最終獲得雙抗菌株NJ13-rif-stre，用NJ13-R表示。
將NJ13-R在NA斜麵培養基上培養2 d為1代，轉接繼代培養，連續培養5代，分別獲得菌株NJ13-R子代F1～F5。分別測定上述各代菌株和NJ13-R與NJ13菌株菌落形態的異同、生物膜形成情況、抗性穩定性和對病原真菌拮抗性差異。
2.4 接種濃度對NJ13-R菌株在人參體內定殖的影響 將NJ13-R接種到含320 mg·L-1利福平和400 mg·L-1硫酸鏈黴素的LB培養液中（50 mL瓶），28 ℃，180 r·min-1培養10 h後，分別用菌體濃度為1×106，1×107，1×108 cfu·mL-1的培養液進行灌根處理，每株灌注50 mL菌懸液，以清水處理為對照，每個處理3次重複，接種後1，3，5，8，11，15，20 d取樣，分別從根、莖、葉內分離回收NJ13-R菌株，采用含400 mg·L-1硫酸鏈黴素和320 mg·L-1利福平的NA選擇性平板培養基進行NJ13-R菌體的回收。菌株的定殖量按照以下公式計算。