普伐他汀對培養人內皮祖細胞藥理作用的影響
調查與實驗研究
作者：肖剛峰 張懷勤
[摘要] 目的 觀察普伐他汀對培養人內皮祖細胞（EPC）數量、增殖、遷移、黏附及一氧化氮（NO）合成能力的影響。 方法 采用密度梯度離心法分離人外周血單個核細胞，貼壁篩選法培養內皮祖細胞，培養7 d後收集細胞並分別加入普伐他汀10 μmol/L及100 μmol/L，幹預48 h， 免疫組化、熒光顯微鏡和流式細胞儀鑒定內皮祖細胞， 分別觀察內皮祖細胞的數量、增殖遷移黏附能力、細胞內皮型一氧化氮合酶（eNOS）、mRNA 的表達以及培養液中NO的水平。 結果 普伐他汀組促進外周血內皮祖細胞擴增，並顯著改善外周血內皮祖細胞的黏附、遷移、增殖以及eNOS mRNA 表達和NO 合成的能力。 結論 他汀類藥物可增加培養人內皮祖細胞數量並改善其功能。
[關鍵詞] 普伐他汀；內皮祖細胞；細胞培養
[中圖分類號] R965 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2013）06-0016-03
他汀類藥物是目前臨床上最常見的血脂調節藥物，廣泛應用於動脈粥樣硬化、高脂血症等疾病的防治，其作用機製為抑製膽固醇合成途徑的HMG-CoA還原酶，從而降低低密度脂蛋白膽固醇水平。近年來研究發現，其除降脂作用外還存在非降脂作用，比如能改善血管內皮功能，上調成熟血管內皮細胞eNOS的活性和NO的合成[1]。內皮祖細胞（EPC）作為血管內皮的前體細胞，具有血管內皮細胞相似的特性，不僅參與新生血管形成（angiogenesis）以及出生後血管生成（vasculogenesis），而且參與損傷內皮的修複，在血管內皮功能中扮演著重要的角色。為進一步研究他汀類藥物改善內皮功能的機製，本實驗觀察了普伐他汀對體外培養的內皮祖細胞數量和功能的影響。
1 材料與方法
1.1 材料與試劑
實驗血樣取自成年健康男性誌願者外周血約80 mL。普伐他汀由浙江大學醫學院心血管病研究所贈予。MTT試劑、培養基M199（Sigma公司），FITC-抗鈣黏著蛋白單克隆抗體（VE-Cadherin，Bender system TM 公司），PE-抗CD34單克隆抗體（CALTAG LABORATORIES），FITC-抗CD133單克隆抗體（R&D公司）， PE-抗VEGFR-2單克隆抗體，Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL，Molecular Probe公司），Ⅷ因子相關抗原免疫組化試劑盒（武漢博士德生物工程有限公司），改良的Boyden 小室（江蘇海門麒麟醫用儀器廠），RT-PCR試劑盒（寶生物工程大連有限公司），內皮型一氧化氮合成酶 PCR引物（上海生物工程有限公司），GAPDH引物（Clontech公司），NO測試盒（南京建成生物工程研究所）。其餘為市售試劑。
1.2 方法
1.2.1 EPC的培養和鑒定 取成年健康男性新鮮外周血80 mL，加等體積Hank’s液稀釋並混勻後采用離心法獲取單個核細胞，將細胞接種於包被纖維連接蛋白的24孔培養板中，M199培養基（包含有VEGF 10 ng/mL、20%胎牛血清、鏈黴素100 IU/mL及青黴素100 IU/mL）中培養，3 d後洗去未貼壁的懸浮細胞，更換相同培養液繼續培養。
0.25%胰酶消化培養第6天貼壁細胞，製成單個細胞懸液，應用流式細胞儀分別檢測細胞VE-Cadherin、VEGFR-2、CD34及CD133表達。培養第6天將細胞與終濃度2.4 μg/mL 的Dil標記的乙酰化低密度脂蛋白（Dil-ac-LDL）避光共孵育4 h，洗去培養液後熒光顯微鏡下觀察細胞熒光來檢測細胞對Dil-ac-LDL的攝取。細胞Ⅷ因子相關抗原的表達采用免疫組化法測定。根據細胞形態、流式細胞術、熒光細胞化學染色、免疫組化等結果，綜合判定培養細胞是否為人內皮祖細胞。
1.2.2 分組 將培養第7天的各孔細胞消化下來並接種到24孔培養板上，接種密度為1×104/cm2。隨機分為3組：① 常規培養液的對照組，②10 μmol/L普伐他汀條件培養液的幹預組，③100 μmol/L普伐他汀條件培養液的幹預組。每組6孔，培養48 h後，進行數量和功能的測定。
1.2.3計數EPC數量 在顯微鏡下對各孔具有典型內皮細胞形態的貼壁紡錘形細胞進行計數（×200各孔取上下左右中5個視野）。