（6）25％三氯化銻——三氯甲烷溶液：用三氯甲烷配製25％三氯化銻溶液儲於棕色瓶中注意避免吸收水分。
（7）50％氫氧化鉀溶液。
（8）維生素A標準液：用脫醛乙醇溶解維生素A標準品視黃醇（純度85％），使其濃度大約為1mL相當於1mg視黃醇，臨用前用紫外分光光度法標定其準確濃度。
（9）酚酞指示劑：用95％乙醇配製成1％溶液。
2.器材
實驗室常用設備、分光光度計、回流冷凝裝置等。
3.材料
魚肝油等。
【實驗操作】
維生素A極易被光破壞，實驗操作應在微弱光線下進行。
1.樣品處理
根據樣品性質可采用皂化法或研磨法。
（1）皂化法
①皂化：根據樣品中維生素A含量的不同，稱取0.5～5g樣品於三角瓶中，加入20～40mL無水乙醇及10ml50％氫氧化鉀於電爐上回流30min至皂化完全為止。皂化法適用於維生素A含量不高的樣品，可減少脂溶性物質的幹擾，但全部實驗過程費時且易導致維生素A的損失。
②提取：將皂化瓶內混合物移至分液漏鬥中，以30mL水洗皂化瓶。洗液並入分液漏鬥，如有渣子可用脫脂棉漏鬥濾入分液漏鬥內。用50mL乙醚分二次洗皂化瓶，洗液並入分液漏鬥中。振搖並注意放氣，靜置分層後，水層放入第二個分液漏鬥內。皂化瓶再用約30mL乙醚分二次衝洗，洗液傾入第二個分液漏鬥中。振搖後靜置分層，水層放入三角瓶中，醚層與第一個分液漏鬥合並。重複至水液中無維生素A為止。
③洗滌：用約30mL水加入第一個分液漏鬥中，輕輕振搖，靜置片刻後放去水層。加15～20mL0.5mol／L氫氧化鉀液於分液漏鬥中，輕輕振搖後棄去下層堿液，除去醚溶性酸皂。繼續用水洗滌，每次用水約30mL，直至洗滌液與酚酞指示劑呈無色為止。大約洗滌3次，醚層液靜置10～20min，小心放出析出的水。
④濃縮：將醚層液經過無水硫酸鈉濾入三角瓶中，再用約25mL乙醚衝洗分液漏鬥和硫酸鈉，兩次洗液並入三角瓶內。置水浴上蒸餾回收乙醚，待瓶中剩約5mL乙醚時，取下用減壓抽氣法至幹。立即加入一定量的三氯甲烷，使溶液中維生素A含量在適宜濃度範圍內。
（2）研磨法
①研磨：精確稱2～5g樣品，放入盛有3～5倍樣品重量的無水硫酸鈉研缽中，研磨至樣品中水分完全被吸收並均質化。研磨法適用於每g樣品維生素A含量大於510μg樣品的測定。如肝樣品的分析，步驟簡單省時，結果準確。
②提取：小心地將全部均質化樣品移入帶蓋的三角瓶內，準確加入50～100mL乙醚，緊壓蓋子用力振搖2min，使樣品中維生素A溶於乙醚中。使其自行澄清大約需12h，或離心澄清。因乙醚易揮發，氣溫高時應在冷水浴中操作，裝乙醚的試劑瓶也應事先置於冷水浴中。
③濃縮：取澄清提取乙醚液2～5mL，放入比色管中在70～80℃水浴上抽氣蒸幹。立即加入1mL三氯甲烷溶解殘渣。
2.標準曲線的製備
準確取一定量的維生素A標準液於4～5個容量瓶中，以三氯甲烷配製標準係列。再取相同數量比色管順次取1mL三氯甲烷和標準係列使用液1mL，各管加入乙酸酐1滴，製成標準比色列。於620nm波長處，以三氯甲烷調節吸光度至零點，將其標準比色列按順序移入光路前，迅速加入9mL三氯化銻——三氯甲烷溶液，於6s內測定吸光度。將吸光度為縱坐標，以維生素A含量為橫坐標，繪製標準曲線圖。
3.樣品測定
於一比色管中加入10mL三氯甲烷，加入一滴乙酸酐為空白液；另一比色管中加入1mL三氯甲烷，其餘比色管中分別加入1mL樣品溶液及1滴乙酸酐，其餘步驟同標準曲線的製備。
【結果處理】
X=C／m×V×100／1000
式中X——樣品中含維生素A的量mg／100g，如按國際單位，每1國際單位=0.3μg維生素A；
C——由標準曲線上查得樣品中含維生素A的含量，μg／mL；
m——樣品質量，g；
V——提取後加三氯甲烷定量之體積，mL；
100——以每百克樣品計。
【思考題】
（1）簡述維生素A的生理功能。
（2）除比色法外，維生素A的測定方法有哪些？
實驗三十七：維生素B2的定量測定
【實驗目的】
（1）了解熒光法測定核黃素的原理並掌握測定方法。
（2）學會使用熒光光度計。
（3）掌握樣品處理及測定方法。
【實驗原理】
維生素B2是一種重要的水溶性維生素，廣泛存在於動物中，牛乳、蛋黃、動物肝髒及綠色植物中含量豐富。維生素B2耐熱，對空氣、氧氣穩定，微溶於水，水溶液呈黃綠色熒光。在稀溶液中，熒光的強度與核黃素的濃度成正比，當加入氧化劑低亞硫酸鈉後，樣品中的雜質和維生素B2都被還原成無熒光物質。由還原前後的熒光差值可以測定維生素B2的含量。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）低亞硫酸鈉（Na2S2O4）。
（2）1mol／L及0.1mol／LHCl溶液。
（3）0.1mol／LNaOH溶液。
（4）核黃素標準溶液（0.5mg／L）：吸取貯備液（25mg／L）1mL，用水稀釋至50mL，用時現配。
2.器材
熒光光度計、電爐、l00mL容量瓶、漏鬥、濾紙等。
3.材料
牛乳。
【實驗操作】
1.樣品處理
稱取牛乳5～10g（或勻漿後的菠菜，含維生素B2以5～10μg為宜）於100mL燒杯中，加入0.1mol／L鹽酸50mL，放置滅菌鍋中處理30min（或常壓下加熱水解），冷卻後用0.1mol／L氫氧化鈉調至pH6.0，再立即用1mol／L鹽酸調pH至4.5，即可使雜質沉澱。將此液移至l00mL容量瓶中，加水定容，過濾。