實驗一：薄層層析法分離氨基酸
【實驗目的】
（1）理解薄層層析分離和鑒定有機物的原理，掌握基本操作方法。
（2）學會應用薄層層析技術分析樣品中氨基酸的種類。
【實驗原理】
薄層色譜是把吸附劑或支持物（如氧化鋁、矽膠和纖維素粉等）均勻地鋪在一塊玻璃板上形成薄層，將分離樣品滴加在薄層的一端，並浸在適宜的展開劑中，在密閉的層析缸中展層。不同的氨基酸由於理化性質不同，在吸附劑表麵的吸附能力各異，隨著展開劑的展開其移動速度不同，使不同的氨基酸得以分離。氨基酸在薄層上的移動速率用Rf（比移值）表示。
Rf=原點到層析斑點中心的距離原點到溶劑前沿的距離
一種物質在固定的條件下有固定的Rf值，不同物質在相同的條件下可有不同的Rf值。因此，未知物與已知物（標準物質）在相同條件下進行展開，比較Rf值可提供定性依據。
薄層層析具有設備簡單、速度快、分離效果好、靈敏度高以及能使用腐蝕性顯色劑等優點，是一種微量的分離分析方法。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）標準氨基酸溶液
①0.01mol／L精氨酸：稱取精氨酸17.4mg溶於10ml90％異丙醇溶液中。
②0.01mol／L甘氨酸：稱取甘氨酸7.5mg溶於10ml90％異丙醇溶液中。
③0.01mol／L酪氨酸：稱取丙氨酸18.1mg溶於10ml90％異丙醇溶液中。
④氨基酸混合液：上述三種氨基酸溶液各取1mL混合。
（2）矽膠G（層析純）。
（3）展層劑：正丁醇：冰醋酸：水=80：20：20。
（4）顯色劑：0.5％茚三酮——丙酮溶液。
2.器材
層析缸、層析玻璃板（5cm×15cm）、毛細管、吹風機、恒溫幹燥箱、喉頭噴霧器等。
【實驗操作】
薄層色譜技術包括製板、點樣、展開、顯色等步驟。現分述如下。
1.薄層板的製備
稱取矽膠G2g放入小燒杯中，加蒸餾水5mL，調成糊狀，倒在玻璃板上，均勻攤開，輕振玻板，使其均勻分布，室溫下自然晾幹，然後放入105°C的烘箱中活化0.5h取出備用。
2.點樣
用毛細管或微量注射器分別取精氨酸、甘氨酸、酪氨酸及混合氨基酸，在上述製好的薄層板一端約2.5cm處，間距1cm寬，垂直地輕觸點樣。第一次點的樣品幹後在原點樣處重複加點一次，直徑一般以2～4mm為宜。
3.展層
在層析缸中放入展層劑約1cm厚，蓋上缸蓋，平衡0.5h。將點好試樣的薄層板樣點一端朝下放入缸內（切勿使樣點浸入溶劑中），蓋好缸蓋。展開劑因毛細管效應而沿薄層上升，樣品中組分隨展開劑在薄層中以不同的速度自下而上移動導致分離。當展開劑前沿上升到樣點上方10～15cm時取出薄層板，放平，標明溶劑前沿位置，用電吹風冷風吹走溶劑。
4.顯色
將除去展開劑的層析板均勻噴上茚三酮顯色劑，然後置於80℃下烘幹20～30min（也可用電吹風吹幹），即出現紫色斑點。
【結果處理】
根據層析圖譜，計算各種氨基酸的Rf值，並確定混合氨基酸樣品中的組成成分。
【注意事項】
（1）薄層板製備的好壞直接影響色譜的結果，薄層應盡量鋪得均勻，厚度在0.25～0.5mm之間。
（2）最理想的Rf值為0.4～0.5，良好的分離Rf值為0.15～0.75，如果Rf值小於0.15或大於0.75則分離不好，就要調換展開劑重新展開。
實驗二：紙層析法分離氨基酸
【實驗目的】
（1）掌握紙層析法分離氨基酸的基本原理和方法。
（2）掌握應用紙層析技術分析樣品中未知氨基酸種類的方法。
【實驗原理】
紙層析（Paper Chromatography，簡稱PC），是以濾紙作為惰性支持物的分配層析，濾紙纖維上親水性的羥基吸附水作為固定相，有機溶劑為流動相。有機溶劑自上而下流動稱為下行層析，自下而上流動稱為上行層析。將樣品點在濾紙上進行展層，樣品中的各種氨基酸即在二相中不斷進行分配，由於不同氨基酸的分配係數不同，故在流動相中移動速率不同，從而使各種氨基酸得到分離。物質被分離後在紙層析圖譜上的位置用Rf值（比移值或遷移率）來表示：
Rf=原點到層析斑點中心的距離原點到溶劑前沿的距離
某種物質的Rf值大小受物質的結構、性質等因素影響，在一定條件下（如溫度、展層溶劑的組分、pH、濾紙的質量等）Rf值是常數，據此可進行定性分析。如果溶質中氨基酸組分較多或其中某些組分的Rf值相同或相近，用單向層析不易將它們分開，可進行雙向層析。雙向層析是在第一溶劑展開後，將濾紙轉動90°，再用另一種溶劑展層。無色物質的紙層析圖譜可用光譜法（紫外光照射）或顯色法鑒定，氨基酸紙層析圖譜常用茚三酮或吲哚醌作為顯色劑。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）甘氨酸溶液：50mg甘氨酸溶於5mL蒸餾水中。
（2）甲硫氨酸溶液：25mg甲硫氨酸溶於5mL蒸餾水中。
（3）亮氨酸溶液：25mg亮氨酸溶於5mL蒸餾水中。
（4）氨基酸混合液：甘氨酸50mg、亮氨酸25mg、甲硫氨酸25mg共溶於5mL水中。
（5）展層劑：正丁醇：冰乙酸：水=4：1：5（體積比）混合後放置半天以上，取上清液備用。
（6）顯色劑：0.5％茚三酮——丙酮溶液。
2.器材
層析濾紙、燒杯、剪刀、層析缸、培養皿、喉頭噴霧器、微量加樣器或毛細管、吹風機、直尺、鉛筆等。
【實驗操作】
1.飽和層析缸
將盛有展層劑的培養皿和盛有平衡溶劑的小燒杯置於密閉的層析缸中。
2.畫原線
戴上指套或橡皮手套，在長約20cm，寬約18cm的層析濾紙上，距一端邊緣2～3cm處用鉛筆劃一條直線，在此直線上每間隔2cm做一記號，等待點樣。
3.點樣
用微量注射器或毛細管依次分別點上甘氨酸、甲硫氨酸、亮氨酸和混合氨基酸溶液。點樣點幹後可重複加點1～2次。點樣量以每種氨基酸含5～20μg為宜，每點在濾紙上的擴散直徑範圍在3mm內為最佳。
4.層析
1—濾紙2—平衡液3—展開劑
用針線將濾紙縫成圓筒狀，注意紙的兩邊不能接觸，留一定縫隙。將濾紙垂直立於培養皿中，點樣端在下且必須在展層劑的液麵之上。蓋好層析缸，待溶劑上升至距濾紙上端2cm左右時取出濾紙，用鉛筆在溶劑前沿劃一邊界線，自然幹燥或用電吹風機吹幹溶劑。
5.顯色
用噴霧器均勻噴上0.5％茚三酮——丙酮溶液，然後置80℃烘箱烘烤5min或用電吹風機熱風吹幹即可顯出各層析斑點。用鉛筆劃下層析斑點，可進行定性、定量測定。
【結果處理】
根據層析結果分別求出各種氨基酸的Rf值，並確定混合氨基酸的組分。
【思考題】
（1）為什麼不同的氨基酸有不同的Rf值，影響本實驗Rf值精確性的因素有哪些？
（2）實驗過程為什麼不能直接用手接觸濾紙？
實驗三：氨基氮的測定——甲醛滴定法
【實驗目的】
（1）理解並掌握甲醛滴定法測定氨基酸含量的原理和方法。
（2）熟練掌握分析滴定技術，準確把握滴定終點。
【實驗原理】
水溶液中的氨基酸為兩性離子，因而不能直接用堿滴定氨基酸的羧基。用甲醛處理氨基酸，甲醛與氨基結合，可形成—NH—CH2OH、—N（CH2—OH）2等羥甲基衍生物，使NH3+放出的H＋遊離出來，這樣就可用堿滴定放出的H＋，測定氨基氮。
如果樣品中隻含一種已知氨基酸，即可算出該氨基酸的含量。如果樣品是多種氨基酸的混合物（如蛋白水解液），則滴定結果不能作氨基酸的定量依據。但用此法可測定蛋白質的水解程度，滴定值隨水解程度的增加而升高，當水解完全後，滴定值保持平衡。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）酚酞指示劑：0.5g酚酞溶於100ml60％乙醇中。
（2）0.05％溴麝香草酚藍溶液：0.05g溴麝香草酚藍溶於100ml20％的乙醇中。
（3）0.100mol／L或0.100mol／L標準NaOH溶液，可采用標準HCl溶液標定。
（4）中性甲醛溶液：分析純甲醛溶液50mL，加約3mL0.5％酚酞指示劑，滴加0.1mol／LNaOH溶液，使溶液呈微粉紅色，臨用前配製。
（5）1％甘氨酸溶液：1.0g甘氨酸溶於100mL蒸餾水中。
（6）10％乙酸溶液：取相對密度為1.05的乙酸97mL，加蒸餾水至1000mL。
2.器材
錐形瓶、25mL堿式滴定管、移液管等。
【實驗操作】
1.已知氨基酸溶液中氨基氮的測定
取3隻錐形瓶，編號1、2、3。於1、2號瓶中各加甘氨酸溶液2.0mL及水5.0mL；於3號瓶中加水7.0mL。然後3隻錐形瓶中各加入甲醛溶液5.0mL、0.05％溴麝香草酚藍溶液兩滴及0.5％酚酞4滴。然後用標準0.0100mol／LNaOH溶液滴定至紫色，記錄各管消耗氫氧化鈉的體積。
2.樣品中遊離氨基酸的測定
（1）樣品中遊離氨基酸的提取稱取樣品（如穀物）2.0～4.0g放在研缽中，加5.0mL10％乙醇溶液研磨成勻漿，然後用少量蒸餾水多次洗滌，轉移入50mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，過濾，濾液即為樣品提取液。
（2）滴定在三角瓶中加入上述樣品提取液2.0mL、蒸餾水4.0mL及3滴0.5％的酚酞指示劑，搖勻後用0.0100mol／LNaOH溶液滴定至微紅色；然後加入4.0mL甲醛溶液，搖勻後放置片刻，再用0.0100mol／LNaOH溶液滴定至微紅色，記下加入甲醛後所消耗的標準氫氧化鈉的體積。再用蒸餾水代替樣品提取液做空白實驗。
【結果處理】
1.氨基酸溶液中氨基氮含量的計算
氨基氮含量（mg／mL）＝VA-VBV×c×K×1000
2.樣品中氨基酸含量的計算
氨基氮含量（％）＝（VA-VB）×V1V×m×c×K×100
式中VA——滴定樣品消耗NaOH溶液的mL數；
VB——滴定空白消耗NaOH溶液的mL數；
c——滴定時所用標準氫氧化鈉的濃度，mol／L；
K——1ml1mol／LNaOH相當於氮的質量（g），K=0.014；
V——滴定時所用樣品液的體積，mL；
V1——樣品提取液的總體積，mL；
m——樣品質量，g。
【思考題】
為什麼不能用氫氧化鈉直接滴定氨基酸？
實驗四：蛋白質的沉澱反應
【實驗目的】
（1）理解蛋白質沉澱反應的原理。
（2）學會沉澱蛋白質的各項技術。
（3）掌握鹽析法沉澱蛋白質的原理。
【實驗原理】
在水溶液中，蛋白質分子表麵結合大量的水分子，形成水化膜，同時蛋白質分子本身帶有電荷，可與溶液的反離子作用，形成雙電層。水化膜和雙電層使每個蛋白質分子成為一個穩定的膠粒，整個蛋白質溶液就形成穩定的親水溶膠體係。當某些物理化學因素導致蛋白質分子失去水化膜或電荷甚至變性時，它就喪失了穩定因素，以固體形式從溶液中析出，這就是蛋白質的沉澱作用。蛋白質的沉澱作用可分為兩類。
1.可逆沉澱
在發生沉澱作用時，雖然蛋白質已沉澱析出，但其分子內部結構並沒發生明顯的改變，仍保持原有的結構和性質，如除去沉澱因素，蛋白質可重新溶解在原來的溶劑中，這種沉澱稱為可逆沉澱作用，也稱為不變性沉澱。鹽析作用、低溫下有機溶劑以及利用等電點的沉澱均屬可逆沉澱，在純化蛋白質時常利用此類反應。
鹽析作用是指用大量的中性鹽使蛋白質從溶液中析出的過程。高濃度的中性鹽既可奪去蛋白質分子的水化膜，又可中和蛋白質分子所帶的電荷，從而破壞蛋白質溶膠的穩定性，使蛋白質沉澱析出。但中性鹽並不破壞蛋白質的分子結構和性質，因而，如除去中性鹽或降低鹽的濃度，蛋白質就會重新溶解。
在蛋白質溶液中加適量乙醇或丙酮，蛋白質分子因水化膜被破壞而沉澱，若及時將蛋白質沉澱與丙酮或乙醇分離，蛋白質沉澱則可重新溶解於水中，但操作必須在低溫下進行。
2.不可逆沉澱
一些物理化學因素往往會導致蛋白質分子結構尤其是空間結構破壞，因而失去其原來的性質，這種蛋白質沉澱不能再溶解於原來的溶劑中，所以稱為不可逆沉澱或變性沉澱。重金屬鹽、生物堿試劑、過酸、過堿、加熱、振蕩、超聲波和有機溶劑等都能使蛋白質發生不可逆沉澱。
重金屬鹽類Cu2+、Ag+、Pb2+、Hg2+等均能與蛋白質分子中的巰基等基團結合，生成不溶物而沉澱。植物體內具有顯著生理作用的含氮堿性化合物稱為生物堿（或植物堿），能沉澱生物堿或與其產生顏色反應的物質稱為生物堿試劑，如鞣酸、苦味酸、磷鎢酸等。生物堿試劑能與蛋白質結合形成不溶物，使蛋白質沉澱。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）飽和硫酸銨溶液：稱取固體（NH4）2SO4850g溶於1000mL蒸餾水中，在70～80°C下攪拌促溶，室溫中放置過夜，瓶底析出白色結晶，上清液即為飽和硫酸銨溶液。
（2）飽和苦味酸溶液：取2g苦味酸放入三角瓶中，加蒸餾水100mL，80°C水浴約10min使之完全溶解，於室溫下冷卻後瓶底析出黃色沉澱，上清液即為飽和苦味酸溶液，此溶液可保存數年。
（3）1％醋酸鉛溶液。
（4）1％硫酸銅溶液。
（5）1％三氯乙酸溶液。
（6）5％鞣酸溶液。
（7）1％醋酸溶液。
（8）硫酸銨粉末。
2.器材
試管及試管架、滴管、吸管、抽濾瓶、量筒、漏鬥、紗布、玻棒、錐形瓶等。
3.材料
蛋清或血清。
【實驗操作】
1.製備蛋白溶液
取20mL蛋清，加蒸餾水至200mL，充分攪拌後用紗布過濾，除去不溶物。
2.鹽析作用沉澱蛋白質
取1支試管加入5mL蛋白質溶液和5mL飽和硫酸銨溶液，混勻，靜置約10min，球蛋白則沉澱析出。過濾後向濾液中加入硫酸銨粉末，邊加邊用玻璃棒攪拌，直至粉末不再溶解達到飽和為止，析出的沉澱為清蛋白，再加水稀釋，觀察沉澱是否溶解。
3.乙醇沉澱蛋白質
取1支試管加蛋白質溶液2mL，加入晶體氯化鈉少許（加速沉澱並使沉澱完全），待溶解後再加入95％乙醇2mL混勻，觀察有無沉澱析出。
4.有機酸沉澱蛋白質
取1支試管，加入蛋白質溶液約2mL，再滴加1％三氯乙酸溶液1mL，觀察蛋白質沉澱。
5.重金屬鹽沉澱蛋白質
取2支試管，各加蛋白質溶液2mL，一管內滴加1％醋酸鉛溶液2～3滴，另一管內滴加1％硫酸銅2～3滴，觀察沉澱的生成。
6.生物堿試劑沉澱蛋白質
取2支試管，各加蛋白質溶液2mL及1％醋酸溶液4～5滴。一管滴加5％鞣酸溶液2～3滴，另一管滴加飽和苦味酸溶液4～5滴，觀察沉澱的生成。
【結果處理】
（1）將實驗結果列表整理。
（2）結合理論知識解釋實驗結果。
實驗五：蛋白質的兩性反應和等電點測定
【實驗目的】
（1）了解蛋白質的兩性解離性質。
（2）初步學會測定蛋白質等電點的方法。
【實驗原理】
蛋白質由許多氨基酸組成，雖然絕大多數的氨基與羧基成肽鍵組合，但是總有一定數量自由的氨基與羧基，以及酚基、巰基等酸堿基團。因此蛋白質和氨基酸一樣是兩性電解質。調節溶液的酸堿度達到一定的氫離子濃度時，蛋白質分子所帶的正電荷和負電荷相等，以兼性離子狀態存在，在電場內該蛋白質分子既不向陰極移動，也不向陽極移動，這時溶液的pH稱為該蛋白質的等電點（pI）。當溶液的pH低於蛋白質等電點時，即在較多H+的條件下，蛋白質分子帶正電荷成為陽離子；當溶液的pH高於蛋白質等電點時，即在OH——較多的條件下，蛋白質分子帶負電荷成為陰離子。
處於等電點的蛋白質表現為電中性，在溶液中的穩定性很低，溶解度最小，容易沉澱析出。將酪蛋白溶液分別置於連續不同的pH環境中，通過觀察混濁程度可測得酪蛋白的等電點。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）0.5％酪蛋白溶液（以0.01mol／L氫氧化鈉溶液作溶劑）。
（2）0.5％酪蛋白——醋酸鈉溶液：稱取純酪蛋白0.25g，加蒸餾水20mL及1.00mol／L氫氧化鈉溶液5mL（必須準確），搖動使酪蛋白溶解。然後加1.00mol／L醋酸5mL（必須準確），轉移到50mL容量瓶中，用蒸餾水定容到刻度，混勻。
（3）0.01％溴甲酚綠指示劑。
（4）0.02mol／L鹽酸溶液。
（5）0.01mol／L醋酸溶液、0.1mol／L醋酸溶液、1.00mol／L醋酸溶液。
（6）0.02mol／L氫氧化鈉溶液。
2.器材
試管及試管架、滴管、吸量管（1mL和5mL）。
【實驗操作】
1.蛋白質的兩性反應
（1）取1支試管，加0.5％酪蛋白溶液20滴和0.01％溴甲酚綠指示劑5～7滴，混勻。觀察溶液呈現的顏色，並說明原因。
（2）用細滴管緩慢加入0.02mol／L鹽酸溶液，隨滴隨搖，直至有明顯的大量沉澱發生，此時溶液的pH接近於酪蛋白的等電點。觀察溶液顏色的變化。
（3）繼續滴入0.02mol／L鹽酸溶液，觀察沉澱和溶液顏色的變化，並說明原因。
（4）再滴入0.02mol／L氫氧化鈉溶液進行中和，觀察是否出現沉澱，解釋其原因。繼續滴入0.02mol／L氫氧化鈉溶液，為什麼沉澱又會溶解？溶液的顏色如何變化？說明了什麼問題？
2.酪蛋白等電點的測定
（1）取9支粗細相近的幹燥試管，編號後加入各種試劑。
試管編號：1、2、3、4、5、6、7、8、9
蒸餾水／mL：2.4、3.2、—、2.0、3.0、3.5、1.5、2.75、3.38
1mol／L醋酸溶液／mL：1.6、0.8、—、—、—、—、—、—、—
0.1mol／L醋酸／mL：—、—、4.0、2.0、1.0、0.5、—、—、—
0.01mol／L醋酸溶液／mL：—、—、—、—、—、—、2.5、1.25、0.62
酪蛋白醋酸鈉／mL：1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0、1.0
溶液最終pH：3.5、3.8、4.1、4.4、4.7、5.0、5.3、5.6、5.9
沉澱出現情況
（2）混勻後觀察上述各管的混濁程度，靜置約20min，再視其沉澱情況，以--，+，++，+++，++++符號表示沉澱的多少。
【結果處理】
根據觀察的結果，判斷酪蛋白的等電點（混濁顯著或靜置後沉澱最多，上部溶液變得最清亮管的pH即為酪蛋白的等電點），並回答操作過程中反應現象及其原因。
【注意事項】
（1）該實驗要求各種試劑的濃度和加入量必須相當準確，實驗過程嚴格按照定量分析的操作進行。
（2）為了保證實驗的重複性或為了進行大批量實驗，可以事先按照上述比例配製成大量的9種不同濃度的醋酸溶液，實驗時再分別準確吸取4mL該溶液，再各加入1mL酪蛋白——醋酸鈉溶液。
【思考題】
（1）在等電點時蛋白質的溶解度為什麼最低？請結合你的實驗結果和蛋白質的性質加以說明。
（2）是否所有的蛋白質在等電點時必然沉澱析出？為什麼？請舉例說明。
實驗六：雙縮脲法測定蛋白質含量
【實驗目的】
（1）理解雙縮脲法測定樣品中蛋白質含量的原理。
（2）掌握雙縮脲法測定蛋白質含量的操作步驟。
【實驗原理】
兩分子尿素在高溫條件下脫去一分子水而生成的化合物稱為雙縮脲，其內含有兩個肽鍵，能與堿性硫酸銅發生反應生成紫紅色化合物，稱該反應為雙縮脲反應。含有兩個或兩個以上肽鍵的化合物都具有雙縮脲反應。蛋白質含有多個肽鍵，在堿性溶液中可與銅離子形成紫紅色絡合物，並可在540nm比色測定。其顏色深淺與蛋白質濃度成正比，而與蛋白質的相對分子質量及氨基酸組成無關。
雙縮脲法最常用於需要快速但並不需要十分精確的測定。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）標準蛋白質溶液（5mg／mL）：準確稱取經真空幹燥的標準蛋白質（常用牛血清白蛋白或酪蛋白），用0.05mol／L氫氧化鈉溶液配製，冰箱中存放備用。
（2）雙縮脲試劑：稱取1.5g硫酸銅（CuSO4·5H2O）、6g酒石酸鉀鈉（NaKC4H4O6·4H2O），依次溶解於500mL蒸餾水中，在攪拌下加入300ml10％氫氧化鈉溶液，用水稀釋到1000mL。配好的雙縮脲試劑應儲存於塑料瓶中（或內壁塗以石蠟的瓶中），此試劑可長期保存，若瓶中有黑色沉澱出現則需要重配。
2.器材
分析天平、分光光度計、恒溫水浴鍋、試管、吸量管等。
3.材料
動物血清
【實驗操作】
1.直接比較法
取三支試管按下麵操作。
試劑加入量：空白管、標準管、測定管
血清（10倍稀釋）：—、—、1.0
標準蛋白溶液（5mg／mL）：—、1.0、—
蒸餾水／mL：2.0、1.0、1.0
雙縮脲試劑／mL：4.0、4.0、4.0
搖勻，37°C水浴20min後，分光光度計540nm比色，調空白管吸光度為零，測得各管吸光度。
根據測定管和標準管的吸光度值，代入下列公式計算：血清總蛋白質（g／100mL）＝測定管吸光度標準管吸光度×0.005×稀釋倍數×100
2.標準曲線法
（1）標準曲線繪製取幹燥試管6支，編號0～5，按下麵順序加入各試劑。於540nm處測定A值。
試管號：0、1、2、3、4、5
標準蛋白溶液（5mg／mL）／mL：—、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0
蒸餾水／mL：1.0、0.8、0.6、0.4、0.2、—
蛋白質含量／mg／mL：0、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0
A540
各管混勻後，分別加入雙縮脲試劑4.0mL，並充分混勻，37°C水浴20min，在波長540nm處比色，測定各管吸光度值。以溶液中蛋白質濃度為橫坐標，A540為縱坐標繪製標準曲線。作為定量的依據，用該方法製得的標準曲線的線性及重複性較好，一般每配一次溶液作一次標準曲線即可。
（2）樣品測定取未知濃度的蛋白質溶液1.0mL（20倍稀釋血清）置試管內，加入雙縮脲試劑4.0mL，混勻，平行做兩份，與標準曲線各管同時比色。
對照標準曲線，查出蛋白濃度，再按照稀釋倍數計算血清蛋白含量，公式如下：
血清總蛋白質（g／100mL）＝標準曲線上查得的蛋白濃度1000×稀釋倍數×100
【注意事項】
（1）本法測定範圍是每1mL樣品中含1～5mg蛋白質，此濃度在測定線性範圍內。未知濃度的樣品濃度若超過時，則應作適當稀釋。
（2）若樣品中脂類等含量過高，則在30min後會有霧狀沉澱產生，故須注意控製在30min內比色完畢。
實驗七：Folin-酚試劑法測定蛋白質含量
【實驗目的】
（1）了解Folin-酚法測定蛋白質含量的原理。
（2）學會繪製標準曲線。
（3）進一步熟悉分光光度計的操作方法。
【實驗原理】
蛋白質含有兩個以上肽鍵，在堿性溶液中蛋白質與Cu2+形成紫紅色絡合物（雙縮脲反應），這個絡合物及酪氨酸、色氨酸殘基能使磷鉬酸——磷鎢酸試劑（Folin試劑）還原，產生藍顏色，藍色的深淺與芳香族氨基酸的含量成正比，據此可進行比色測定。
本測定法比雙縮脲法靈敏，並使用於酪氨酸和色氨酸的定量測定，對那些含這兩個氨基酸殘基與標準蛋白差異較大的蛋白質來說，有一定誤差。該法可用500nm比色，測定範圍為0.05～0.5mg蛋白質／mL。
【試劑與器材】
1.試劑
（1）試劑A，由下述三種溶液配製：①稱取20g無水碳酸鈉、4g氫氧化鈉溶解於1L水中；②稱取0.2g硫酸銅溶於20mL水；③稱取0.4g酒石酸鉀鈉溶於20mL水。在測定的當天，將這三種溶液按100：1：1的體積比混合，即為Folin-酚試劑A，混合放置30min後使用。混合液隻能用1天，三種溶液分開可長期保存。
（2）試劑B：在2L磨口回流裝置內加入鎢酸鈉（NaWO2·2H2O）100g、鉬酸鈉（Na2MoO4）25g、水700mL、85％磷酸50mL及濃HCl100mL。充分混勻後，以小火回流10h。再加硫酸鋰（Li2SO4）150g、水50mL和數滴溴水，然後開口繼續沸騰15min，以便驅除過量的溴，冷卻後稀釋到1000mL，過濾，溶液呈黃綠色，置於棕色試劑瓶中貯於暗處。使用時用標準氫氧化鈉溶液滴定，以酚酞為指示劑，而後用適量水稀釋，使酸濃度最後為1mol／L，此為Folin-酚試劑B。
（3）標準牛血清白蛋白溶液（0.5mg／mL）。
（4）待測蛋白溶液濃度不超過0.5mg／mL，否則要適當稀釋。
2.器材
試管、吸量管、水浴鍋、分光光度計等。
【實驗操作】
1.標準曲線的繪製
取7支試管，按照下麵要求進行操作。
試管號：0、1、2、3、4、5、6
標準蛋白溶液／mL：—、0.1、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0
蒸餾水／mL：1.0、0.9、0.8、0.6、0.4、0.2、—
蛋白質含量／（mg／mL）：0、0.05、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5
配好後各管加入試劑A5mL，混勻，室溫放置10min後，各管再加試劑B0.5mL，立即混勻，室溫放置30min，在500nm波長處，以0號管調零點，測定各管吸光度值。
以各管吸光度值為縱坐標，蛋白濃度為橫坐標繪製標準曲線。
2.樣品測定
取未知濃度的蛋白質溶液1mL，置於試管內，加入試劑A5mL，混勻，室溫放置10min後，各管再加試劑B0.5mL，立即混勻，室溫放置30min，在500nm波長處，以0號管調零點，測定其吸光度值（平行3次）。
【結果處理】
對照標準曲線求出蛋白質含量。
計算：
樣品蛋白濃度（mg／mL）＝標準曲線所得蛋白質濃度×樣品稀釋倍數
【注意事項】
（1）由於不同蛋白質所含酪氨酸和色氨酸殘基的量不同，致使等量的不同蛋白質所顯示的顏色深度不盡一致，產生誤差。
（2）磷鉬酸——磷鎢酸試劑（Folin-酚試劑B）僅在酸性條件下穩定，而蛋白質的顯色反應需在pH10的環境中進行，因此當試劑B加入後應當立即充分混勻，以便在磷鉬酸——磷鎢酸試劑被破壞之前與蛋白質發生顯色反應，這對於結果的重現性非常重要。
實驗八：考馬斯亮藍染色法測定蛋白質含量
【實驗目的】
（1）理解考馬斯亮藍法測定蛋白質含量的基本原理。
（2）掌握本實驗的操作步驟。
【實驗原理】
考馬氏亮藍G-250在酸性溶液中為棕紅色，當它與蛋白質通過疏水作用結合後，溶液變成藍色，最大吸收波長從465nm轉移到595nm處，在一定的範圍內，蛋白質含量與595nm的吸光度成正比。
該法優點是操作簡單，反應時間短，顏色穩定，抗幹擾性強。缺點是當測定蛋白與標準蛋白氨基酸組成差異較大時，有一定的誤差。