五、結果與討論。
1.統計汙染率。
2.統計誘導率。實訓項目5植物細胞懸浮培養及種細胞篩選技術。
一、實訓目的。
學習和掌握植物細胞懸浮培養方法及常規篩選種細胞的方法。
二、實訓原理。
植物懸浮培養將植物單細胞或小細胞團在液體培養基中於搖床上振蕩，振蕩過程中細胞直接的連接被打斷，使增殖細胞脫落下來。並且，懸浮培養處於理化環境均一的液體培養基中，有害物質不易積累，可以獲得快速增殖的、分散性好、均一的小細胞團。懸浮培養應增加細胞與培養液的接觸麵，改善營養供應，並適當改善氣體交換。
三、用品。
1．器材
超淨工作台、搖床、高壓滅菌鍋、無菌刻度吸管（10mL）、pH酸度計、無菌槍形鑷、手動吸管泵。
2．試劑和材料
MS（液體，含1.0mg/L2，4D）、pH5.7、實訓項目4誘導出來的愈傷組織。
四、操作步驟。
①愈傷組織的誘導。見實訓項目4。
②挑選分散性好、致密、鮮黃色或乳白色、生長旺盛的愈傷組織，放入配製好的液體培養基中，用鑷子輕輕夾碎愈傷組織，掌握好力度不致損傷愈傷組織。每瓶接入約2g愈傷組織，置於轉速為100r/min，25℃，無光照條件下振蕩培養。
③用手動吸管泵吸取已建立的細胞小顆粒懸液，吸出培養液，保留2mL壓縮體積的細胞，轉至25mL/瓶新鮮培養液中，培養條件同步驟②。最初幾代要勤換培養液，以防止褐化，一般3d左右更換一次新鮮培養液，2周後即可恢複正常的繼代頻率，每7d左右更換一次培養液。每次繼代，用寬口吸管或一定孔徑的細胞篩來選擇細胞團，留下生長旺盛的小細胞團，棄去大的細胞團。
五、結果與討論。
1.討論挑取愈傷組織時應注意什麼？
2.應該采用什麼方法來判斷細胞生長狀況？實訓項目6雞胚成纖維細胞原代分離培養。
一、實訓目的。
掌握雞胚成纖維細胞的分離與培養方法和細胞計數方法。
二、實訓原理。
細胞培養分原代培養和傳代培養。原代培養是由體內取出組織，經消化酶（常用胰蛋白酶和膠原酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，將其分散成單細胞，置於合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖。原代培養細胞離體時間短，遺傳性狀和體內細胞相似，適於做細胞形態、功能和分化等研究。原代培養細胞移動性較強，細胞分裂不旺盛，存在異質性細胞。
所有組織中都有一定量的細胞間質（纖維和基質等），對細胞生長有妨礙作用，用胰蛋白酶消化能去除間質，使組織鬆散成單個細胞或小細胞團，易於細胞生長。
三、用品。
9~12d齡雞胚、照蛋燈與蛋座、碘酊棉球與酒精棉球、大剪子、眼科剪、小鑷子、平皿、細菌瓶、吸管、吸球、細胞瓶、0.25%胰酶、DMEM培養液、生長液（含10%犢牛血清、200U/mL青黴素、200μg/mL鏈黴素的DMEM液）。
四、操作步驟。
①取9~12d齡雞蛋用新潔爾滅消毒10min後，大頭朝上置於操作台內。依次用碘酊和酒精消毒氣室部。去除氣室部卵殼和殼膜，穿破絨毛尿囊膜，夾住雞胚頸部，取出雞胚放於滅菌平皿中。
②用眼科剪、小鑷子去除雞胚頭、四肢及內髒，用無血清的DMEM衝洗2次。
③將衝洗後的雞胚用剪子充分剪碎，使其近於乳糜狀。
④將剪碎的組織塊倒入細菌瓶中，加入5mL無血清DMEM，振搖幾次，靜置幾分鍾，吸棄洗液。如此重複1次。
⑤加5mL胰酶，在37℃水浴中消化20~30min，其間需不時搖動，使細胞消化完全（組織塊變鬆散，沉降漸變緩慢時即表示消化足夠）。
⑥消化好後，取出瓶子，靜置幾分鍾，吸去胰蛋白酶液。
⑦加DMEM生長液5mL，輕輕搖動幾次後，靜置幾分鍾吸去。如此重複1次。
⑧加入生長液5mL，以粗口吸管吹吸數次，使細胞脫落分散，靜置幾分鍾，使未消化好的組織塊下沉。
⑨輕輕吸取上層細胞懸液於細胞培養瓶中，每瓶0.2~0.5mL，補加DMEM生長液至10mL，使細胞量為（4~6）×105個/mL，蓋上蓋子，置於37℃CO2恒溫箱中培養。細胞貼壁後延展成長梭形，培養7~10d後即可長成致密單層細胞。
⑩細胞計數方法。
取細胞懸液（0.5+2）mL0.1%結晶紫—枸櫞酸（0.1mol/L）溶液，室溫或37℃溫箱中5~10min，充分振蕩後進行計數。
按白細胞計數法計算4角4個大方格內的細胞總數（N）。
每毫升懸液中的細胞數（n）=N/4×10000×K（稀釋倍數）。
五、結果與討論。
1.記錄每天觀察細胞生長情況和培養液顏色變化。
2.雞胚原代細胞培養時應注意哪些問題？實訓項目7小鼠胚胎成纖維細胞的原代培養。
一、實訓目的。
掌握小鼠成纖維細胞原代培養的方法和步驟，熟悉培養細胞的觀察方法，了解體外培養成纖維細胞的基本形態。
二、實訓原理。
細胞培養分原代培養和傳代培養。原代培養是由體內取出組織，經消化酶（常用胰蛋白酶和膠原酶）、螯合劑（常用EDTA）或機械方法處理，將其分散成單細胞，置於合適的培養基中培養，使細胞得以生存、生長和繁殖。原代培養細胞離體時間短，遺傳性狀和體內細胞相似，適於做細胞形態、功能和分化等研究。原代培養細胞移動性較強，細胞分裂不旺盛，存在異質性細胞。