正文 第13章 澱粉酶的生產工藝(2 / 3)

α澱粉酶的生產方法有液體發酵法和固體培養法兩種。液體發酵法生產的α澱粉酶,經分離提純後,可製得純淨的食品級酶製劑產品,這種產品主要應用在食品、澱粉糖、製藥等直接入口的產品生產中。固體培養法生產的α澱粉酶經幹燥後得到粉劑產品,由於含有多種複雜的酶係和雜質,因此適合於條件要求不高的粗質原料發酵產品中。

(二)α澱粉酶發酵工藝流程

α澱粉酶的發酵生產工藝以玉米粉為碳源,以豆餅為氮源,以枯草芽孢杆菌(bacillussubtilis)為生產菌種。

1)α澱粉酶生產菌種

目前,國內外生產α澱粉酶所采用的菌種主要有細菌和黴菌兩大類,典型的是芽孢杆菌和米曲黴。米曲黴常用固態曲法培養,其產品主要用作消化劑,產量較小。芽孢杆菌則主要采用液體深層通風培養法大規模地生產α澱粉酶,如我國的枯草杆菌BF7658。

大多數枯草芽孢杆菌都能產生大量的澱粉酶,較易得到分離。由於芽孢具有較強的抗熱能力,分離純化時可采用熱處理的方法,高溫加熱處理,殺死樣品中所有不含芽孢的菌類,在培養過程中使芽孢杆菌得到很好的富集。利用該菌產澱粉酶的特性,選擇以澱粉為碳源的分離培養基,菌體分泌的澱粉酶會使菌落周圍的澱粉水解,滴加碘液即可在菌落周圍出現清晰的透明圈。根據透明圈的直徑(C)與菌落直徑(H)之比(C/H)可初步鑒定酶活力的高低,即比值越大酶活力越高,進而篩選出優良的生產用菌。

2)生產原料

固體培養以麩皮為主要原料。酌量添加米糠或豆餅的堿水浸出液,以補充氮源。

液體培養常以麩皮、玉米粉、豆餅粉、米糠、玉米漿等為原料,並適當補充硫酸銨、氯化銨、磷酸銨等無機氮源,此外還需添加少量鎂鹽、磷酸鹽、鈣鹽等。固形物濃度一般為5%~6%,高者達15%,為了降低培養液黏度,澱粉原料可用α澱粉酶液化,氮源可用豆餅堿水浸出液代替。

3)培養基製備

培養基的種類很多,可以根據組成、狀態和用途等進行分類,按照用途可以分成孢子培養基、種子培養基和發酵培養基。微生物大規模發酵設計主要用到孢子、種子和發酵培養基這3種類型。

(1)孢子培養基

孢子培養基配製的目的是供菌體繁殖孢子,常采用的是固體培養基,對這類培養基的要求是能使菌體生長快速,產生數量多而優質的孢子,並且不會引起菌體變異。對孢子培養基的要求:①營養不要太豐富;②所用無機鹽的濃度要適量;③注意培養基的pH和濕度。

將麩皮5%、豆餅粉3%、蛋白腖0.25%、瓊脂2%(pH7.1)製成斜麵培養基,在121.3℃滅菌20min。

(2)種子培養基

種子培養基是供孢子發芽、生長和大量繁殖菌絲體,並使菌絲體長得粗壯成為活力強的種子。對於種子培養基的營養要求比較豐富和完全,氮源和維生素的含量也比較高,濃度以稀薄為好,可以達到較高的溶解氧,供大量菌體生長和繁殖。

豆餅1%、蛋白腖和酵母膏各0.4%、氯化鈉0.05%配置成種子培養基(pH7.1~7.2),在121.3℃滅菌20min。

(3)α澱粉酶的發酵培養基

發酵培養基的要求是營養要適當豐富並完全適合菌種的生理特性和生長要求,能使菌種迅速生長、健壯,能在較短的周期內充分發揮生產菌合成發酵產物的能力,並且要注意成本和能耗。

麩皮70%、小米糠20%、木薯粉10%、燒堿0.5%,加水量達到60%,常壓蒸汽滅菌1h。

4)種子的擴大培養

(1)孢子的製備

將保存在澱粉瓊脂斜麵上的枯草芽孢杆菌孢子用無菌水洗下,接種到錐形瓶中,在35℃靜置培養2~4d,待長出大量孢子後作為接種用的種子。

(2)種子的製備

將保藏的菌種接種到搖瓶種子培養基中,37℃,200r/min搖床培養,培養3d。將培養的種子接入到20L種子罐中進行發酵培養,使菌種迅速生長、複壯,在較短周期內達到生產菌合成發酵產物的能力。種子罐培養條件為:37℃攪拌,通風培養12~24h。菌種進入對數生長期(通過鏡檢,細胞密集,細胞粗壯整齊,大多細胞單獨存在,少數呈鏈狀,發酵液pH6.3~6.8,酶活力5~10U/mL)再接種到發酵罐中。

工藝流程:孢子→錐形瓶→種子罐→發酵罐。

5)α澱粉酶的發酵

發酵罐培養基經過消毒滅菌冷卻後接入3%~5%的種子培養液。培養條件為:37℃,發酵罐壓0.5kg/cm2,風量前20h1:0.48vvm,20h後1:0.67vvm,培養時間40~48h。中途3倍碳源的培養基補料,體積相當於基礎料的1/3,從培養12h開始,每小時1次,分30餘次添加完畢。停止補料後6~8h罐溫不再升高,菌體衰老,80%形成空泡,每2~3h取樣分析1次,當酶活力不再升高,結束發酵。向發酵液中添加2%CaCl2,0.8%Na2HPO4,50~55℃加熱處理30min,以破壞共存的蛋白酶,促使膠體凝聚而易於過濾。冷卻到35℃,加入矽藻土為助濾劑準備過濾。

(三)α澱粉酶發酵的工藝控製

1)發酵的補料策略

中間補料是在發酵過程中補充某些營養物料、水或產酶促進劑以滿足微生物的代謝活性和產酶需求。

α澱粉酶生產中要經常補料,用3倍黏度濃度碳源的培養基補料,體積相當於基礎料的一半,從培養12h開始,每小時1次,分30餘次補加完畢。這樣做延長了發酵的時間,提高了單罐產量和酶的活力。

2)發酵過程pH值的控製

各種微生物需要在一定的pH環境中方能正常生長繁殖,生長培養基的pH對微生物生長和酶的分泌起著重要的作用。在微生物生長過程中pH的變化影響產品的穩定性。商業上所用的通過深層發酵所獲得細菌α澱粉酶的產生菌芽孢杆菌其最適的生長和產酶pH為6~7。pH也是酶合成開始和結束的標誌。在發酵過程中可以通過添加適量的尿素或碳酸鈣來調節pH值的高低。

3)發酵過程的溫度控製

溫度對微生物的生長、產物的合成和代謝調節有重要的作用。溫度變化一方麵影響各種酶反應的速率和蛋白性質,另一方麵影響發酵液的物理性質。溫度對澱粉酶生產的影響與菌體的生長有關。在真菌中對生長溫度在25~37℃產α澱粉酶嗜溫真菌研究表明,α澱粉酶的最適產酶溫度是30~37℃。在細菌中澱粉酶產生菌的生長溫度更寬些。