1.根據來源的不同，α澱粉酶可分為哪兩類？有何不同？2.簡述α澱粉酶與金屬離子的關係。
3.目前α澱粉酶的工業發酵生產菌有哪些？4.影響α澱粉酶工業發酵生產的因素有哪些？5.簡述α澱粉酶工業生產的方法及其優缺點。
6.簡述液體深層培養法生產α澱粉酶的提取、濃縮和提純方法？7.α澱粉酶活力測定的原理是什麼？8.α澱粉酶在實際生產應用中存在的缺陷是什麼？如何解決？知識目標：掌握產纖維素酶菌株的選育：掌握發酵生產纖維素酶的工藝流程：了解影響纖維素酶生產的因素：了解纖維素酶的應用。
技能目標：能製訂纖維素酶發酵生產的技術方案：能進行纖維素酶的發酵生產：能進行纖維素酶的分離提純：能進行纖維素酶活力的測定。
纖維素酶的生產項目簡介：纖維素是自然界中儲存量最多的多糖類物質，它是植物細胞壁的主要構成物質之一，占植物幹重的35%～50%，是地球上分布最廣、含量最豐富的碳水化合物。對人類而言，纖維素又是自然界中數量最大的可再生性物質，它的降解是自然界碳素循環的中心環節。盡管自然界有大量的纖維素，但僅有很少部分用於紡織、造紙、釀造、飼料等領域，還有一部分用於燃料，約有80%未被開發利用，而是通過微生物自然分解或燃燒而參與自然界碳素循環的。自從1906年Seilliere在蝸牛消化液中發現能分解天然纖維素的纖維素酶後，纖維素酶的研究和應用越來越受到全球各地的普遍關注，如將纖維素以工業規模降解，就可使纖維素轉化為人類急需的能源、生化產品和化工原料等，同時還可以處理廢物，消除公害，保護環境。纖維素的利用與轉化對於解決目前世界能源危機、糧食短缺、環境汙染等問題具有十分重要的意義。
纖維素酶自被發現後，人們對其進行了大量的研究。國內關於纖維素酶的特性、作用機理、培養條件、應用試驗等方麵的報道文獻較多。但我國纖維素酶製劑的大規模生產仍未得到有效解決，我國現用的大部分纖維素酶由國外進口，價格較高，國內生產廠商仍較少，技術含量低（主要是固體發酵法生產），滿足不了國內市場的需要，因此，我國纖維素酶製劑工業生產潛力很大，且亟待大力研究開發新酶種、新工藝、新途徑。
本項目主要介紹纖維素酶的發酵生產及其分離提純、活力測定等方麵的內容，並重在實用技能的操作訓練。
重點作業：（1）分組調研纖維素酶在生物能源利用中的應用情況，形成一份調研報告：（2）查閱相關資料，製訂纖維素酶發酵生產技術方案。
工作任務：任務纖維素酶的發酵生產：應知詞彙：纖維素酶：是指能水解纖維素β1，4葡萄糖苷鍵，使纖維素變成纖維二糖和葡萄糖的一組酶的總稱，它不是單一酶，而是起協同作用的多組分複合酶係。
C1酶：葡聚糖外切酶（exo1，4βDglucanase，EC3.2.1.91），俗稱C1酶，這類酶作用於纖維素線狀大分子末端的β1，4糖苷鍵，每次切下一個纖維素二糖分子，故又稱為纖維二糖水解酶（Cellobiohydrolase），來自真菌的稱為CBH，來自細菌的稱為Cex。
Cx酶：葡聚糖內切酶（endo1，4βDglucanase，EC3.2.1.4或1，4βDglucanchydrolase，來自真菌的稱EG），俗稱Cx酶，一般作用於纖維素酶分子內部的非結晶區，任意水解β1，4糖苷鍵，將長鏈纖維素分子截短，產生大量非還原性末端的小分子纖維素。
Cb酶：β葡聚糖苷酶（βGlucosidase，EC3.2.1.21，簡稱BG），俗稱Cb酶或纖維二糖酶，這類酶將纖維二糖水解成葡萄糖分子。
相關知識：7.1.1纖維素酶的性質和作用方式：1）纖維素酶的組分：纖維素酶組分非常複雜，但主要包含3個大類：葡聚糖內切酶（俗稱Cx酶）、葡聚糖外切酶（俗稱C1酶）、β葡聚糖苷酶（俗稱Cb酶）。C1酶和Cx酶主要溶解纖維素，Cb酶主要將纖維二糖、纖維三糖轉化為葡萄糖，當3個主要成分的活性比例適當時，就能協同作用完成對纖維素的降解。其酶催化效率高，比一般酶高106～107倍；酶的催化反應具有高度專一性，酶對其作用底物有嚴格選擇性，催化反應條件溫和，酶催化活力可被調節控製，無毒性。
2）纖維素酶的分子結構：近年來，人們對纖維素酶的分子結構已開展了廣泛的研究，借助現代化分析技術和方法，如重組DNA、電鏡和X射線掃描、用位點修飾和點誘變、局部蛋白水解、親和色譜分離、在特性和配體結合研究方麵的人工基質的采用等，已經取得了較大的進展。
通過對纖維素酶結構的研究發現，作用於同一底物的酶盡管在一級結構上無同源性或同源程度很低，各種纖維素酶的氨基酸排列順序也不盡相同，但酶的蛋白質構架卻普通具有類似的結構，都有一段橢圓形的催化活性中心即催化結構域（CatalyticDomain，CD）和一段長的同源程度很高的尾部結合活性中心即結合結構域（CellulaseBindingDomains，CBD），兩者之間通過一段富含羥基氨基酸和脯氨酸的序列相連，稱為連接橋（Linker，L）。三者功能如下：①連接橋（L）。它的作用可能是保持CD和CBD之間的距離，也可能有助於不同酶分子間形成較為穩定的聚集體。
②結合結構域（CBD）。它對酶的催化活力是非必需的，但它能執行調節酶對可溶性和非可溶性底物專一性活力的作用，其結合纖維素的作用機理目前尚不是很清楚。有人認為CBD是通過氫鍵穩定結晶底物的，纖維素酶的CBD可能位於肽鍵的N末端或C末端。據研究發現，一些細菌的CBD順序有一定的共同特點，即帶電荷氨基酸含量較低，羥基氨基酸含量很高，均含有色氨酸、天冬氨酸和甘氨酸，而且兩個胱氨酸在N末端和C末端的位置完全相同，不過也有一些纖維素酶沒有CBD，如熱梭菌是依靠纖維素酶係中的纖維小體吸附纖維素的。
③催化結構域（CD）。它體現酶的催化活性及對待定水溶性底物的特異性。盡管不同來源纖維素酶的分子量大小差別很大，但它們催化區的大小基本一致。
3）纖維素酶的性質：由不同纖維素酶生產商所生產的纖維素酶，在酶係的組成、相對分子質量、等電點、最適pH值、最適溫度等方麵是不同的，有的甚至相差較大。纖維素酶係中大多數酶作用於底物的最適pH為4.0～6.0；pH穩定範圍大多數在4.0～9.0。另外，最適pH與反應溫度有關，如擬康氏木黴N278的纖維素酶CMC糖化力，30℃時最適pH為5.0，40℃時最適pH為4.8，50℃時最適pH為4.4，60～70℃時最適pH為4.0～4.4。
大多數纖維素酶都具有較高的穩定性，一般最適溫度為40～60℃，溫度穩定範圍為50～70℃，但各組分酶的熱穩定性也有差異，並受到pH的影響。如擬康氏木黴N278的纖維素酶CMC糖化力在pH2.0或pH7.0時，溫度達到40℃，活力便開始降低；在pH3.0或pH6.0時，溫度在50℃以上，活力開始降低；而在較適宜的pH4.0～5.0，溫度在60℃以上，酶活力才開始降低。
纖維素酶的分子大小因來源不同而有明顯的差異。內切酶的相對分子質量介於23000～146000，如真菌的異構酶EGⅠ的相對分子質量約為54000；真菌的異構酶EGⅢ的相對分子質量約為49800。但也有例外，如纖維黏菌EG有兩種菌的內切酶其相對分子質量隻有6300。外切酶的相對分子質量介於38000～118000，如木黴的CBH有兩種異構酶CBHⅠ和CBHⅡ，CBHⅠ的相對分子質量約為66000；CBHⅡ的相對分子質量約為53000。β葡萄糖苷酶的相對分子質量為90000～100000（胞內型）和47000～76000（胞外型）。
另外，纖維素酶的各組分大多數是糖蛋白，但其含糖比例很不相同，糖和蛋白之間的結合方式也不同，有的通過共價鍵連接，有的是可解離的複合物。
.1康氏木黴、綠色木黴纖維素酶的酶學性質菌種酶（組分）相對分子質量含糖量/%等電點最適pH最適溫度/℃綠色木黴Cx4300012～144.5～5.050C1530005.8康氏木黴Cx480004.325.560C1620009.03.80：纖維素酶可由酶促反應的產物和底物類似物引起競爭性抑製，常見的競爭性抑製劑有纖維二糖、葡萄糖和甲基纖維素；植物體內的某些酚、單寧和花色素是天然的抑製劑。鹵素化合物、重金屬、去垢劑和染料等也能使纖維素酶失活。但是，在酶作用條件改變後，一些物質在抑製劑和活化劑之間轉化。如纖維二糖在大多數情況下是抑製劑，但當作用於CMC（羧甲基纖維素鈉）時，有7種纖維素酶被纖維二糖活化。常見的纖維素酶的激活劑有：氟化鈉、Mg2+、氯化鈷、磷酸鈣、Ca2+、中性鹽等，其中，硫酸鎂、氟化鈉和磷酸二氫鈣的激活作用較強。
4）纖維素酶的作用方式：纖維素酶對纖維素的降解，一般先要吸附到纖維素上，但並不是好的吸附就有好的催化降解。纖維素酶的吸附不僅與酶的本身性質有關，也與底物的特性密切相關，其能力大小與酶的含糖量和疏水性有關聯。至於吸附能力是否可逆，則視具體酶的種類而定。如裏氏木黴的CBHⅡ和EGⅢ對纖維素的吸附是個可逆過程，而CBHⅠ對纖維素的吸附是一個不可逆過程。研究還發現，除了CBHⅠ和CD外，酶組分吸附與相應的水解活力之間沒有線性關係。
由於纖維素酶的多組分和纖維素底物具有複雜的超分子結構，給纖維素酶的作用機製的研究帶來困難，所以至今還無完全統一的認識。
纖維素酶的作用機理在大多數天然纖維植物中，除了纖維素外，還具有與纖維素量相當的半纖維素（主要是戊聚糖，還包含一些果膠質）及20%左右的木質素。正是由於木質素、半纖維素對纖維素的保護作用以及纖維素本身的結晶結構，所以用纖維素酶處理天然植物纖維時，其水解程度是很低的，即纖維素水解成糖的比率一般僅為10%～20%。
為了提高酶解效率，就必須對天然的植物纖維進行處理，預處理的目的是解除木質素和半纖維素對纖維素的保護作用和破壞纖維素的結晶結構，從而增加纖維素的表麵積，達到提高水解率的目的。纖維素預處理的方法有物理法、化學法和其他法3大類。物理法包括研磨法、蒸汽爆裂法、高能輻射法、微波處理法、冷凍處理法等；化學法包括堿處理法、溶劑處理法、稀酸處理法等；其他方法包括分解木質素的微生物處理法、加壓SO2氣體蒸煮法等。
纖維素酶的來源：纖維素酶來源非常廣泛，昆蟲、軟體動物、微生物都能產生纖維素酶。目前，人們研究較多的是產酶微生物，包括細菌、放線菌和真菌。細菌類有紅黃纖維弧菌、普通纖維弧菌、瘤胃球菌和熒光極毛杆菌等；放線菌綱有鏈黴菌、玫瑰色放線菌小單胞菌、纖維放線菌及黑紅旋絲放線菌；真菌類主要有木黴（綠色木黴、裏氏木黴、康氏木黴等）、青黴、曲黴和根黴等。雖然許多真菌和細菌都能利用纖維素，但是有的隻產生微生物細胞和代謝產物，如甲烷等，有的微生物產生的纖維素酶隻能水解可溶性纖維素而不能降解天然纖維素。因此，選擇生產菌種應要求它產生的纖維素酶同時具有高活力的C1酶和Cx酶，能夠有效地降解天然纖維素，並且是胞外酶，以便於酶的收集。
不同微生物合成的纖維素酶在組成上有顯著的差異，對纖維素的酶解能力也大不相同。分解纖維素的細菌大多是厭氣性的，生長慢，往往產生大量黏液，所產生酶是胞內酶或吸附在菌壁上，很少能分泌到細胞外，增加了提取純化難度，此外，其纖維素酶產量也不高，且大多數對結晶纖維素沒有活性。分解纖維素的細菌中，研究比較多的有纖維素黏菌屬、生孢纖維素黏菌屬和纖維杆菌屬。曾測定五屬29個種的植物病原細菌，都不產生C1酶、有16種能產生Cx酶。因此工業上很少采用細菌生產纖維素酶。
真菌和放線菌所產生的纖維素酶通常是胞外酶，酶被分泌到培養基中，用過濾和離心等方法就能較容易地得到纖維素酶製品。但由於放線菌產生的纖維素酶的產量極低，且分解纖維素的能力都很弱，所以研究很少。如分枝杆菌很少能分解纖維素，原放線菌雖有較多的種類能在纖維素上生長，但分解纖維素的能力很弱。而絲狀真菌具有產酶諸多優點：①產生纖維素酶為胞外酶，便於酶的分離和提取：②產酶效率高，且產生纖維素酶的酶係結構較為合理：③同時可產生許多半纖維素酶、果膠酶、澱粉酶等。
因此，從纖維素酶工業化製備及其應用角度來看，研究和采用絲狀真菌產酶具有更大意義。
到目前為止，用於研究生產纖維素酶的絲狀真菌包括木黴屬、曲黴屬、毛黴屬、根黴屬、青黴屬、裂襇黴屬、耙黴屬、漆黴屬、葡萄狀穗黴屬、孢黴屬、阿氏黴屬等。其中酶活力較強的菌種是木黴屬、曲黴屬、根黴屬、青黴屬及漆斑黴屬等。這幾種是目前公認較好的纖維素酶生產菌，因其產率高而被廣泛應用。擔子菌中的陀螺菌、蕈類的研究近年來也比較多。真菌產生的纖維素酶一般以Cx酶為主，C1酶活力高的較少。木黴產生的纖維素酶活力最高，粗酶製劑中含有高活力的C1酶和Cx酶。細小青黴和Chrysosporiumpruinosun雖能產生較高活力的C1酶和Cx酶，但穩定性和對棉花的分解能力都不如綠色木黴。曲黴和根黴產生的主要是Cx酶。擔子菌大多數產生Cx酶。隻有少數的擔子菌，如蕈類中的月夜蕈屬的菌能產生較高的C1酶活力。
目前，應用於生產纖維素酶的菌種主要是木黴、黑曲黴和變異青黴，其中尤以木黴應用最為廣泛。我國生產上應用的菌種也大多屬於木黴。從目前研究進展來看，裏氏木黴同時具有較為穩定性狀、優質高產纖維素酶的能力和較好“抗代謝阻遏”能力，被認為是最具有工業應用價值的菌株。
7.1.3產纖維素酶菌株的篩選：微生物菌種是發酵工業生產的重要基礎和條件，優良菌種不僅能提高發酵產品的產量、質量及原料的利用率，而且還能增加產品種類，縮短生產周期，改進生產工藝條件等。因此，選擇一個優良的產酶菌株對微生物酶的生產來說至關重要。
裏氏木黴最早是在20世紀50年代，由美國的Reese博士從腐爛的纖維材料上分離出來的，最初鑒定為綠色木黴（T.viride），研究發現該菌分泌胞外纖維素酶的能力最強，由該菌產生的纖維素酶複合體係具有分解天然纖維素所需要的三類酶組分，已知共8種不同的纖維素酶能協同水解纖維素底物，有效地將纖維素轉化為葡萄糖，為紀念Reese的傑出貢獻，綠色木黴（T.viride）後來被更名為裏氏木黴（T.seesei）。下麵簡單介紹重要的纖維素酶產生菌裏氏木黴的篩選。
1）樣本采集：由於纖維素酶的作用底物為纖維素，所以可以從森林或常年堆放木材、秸稈等的地方收集土樣和朽木、腐爛的秸稈等材料，從中分離裏氏木黴。
2）裏氏木黴的分離：將采集的土樣用無菌水梯度稀釋，朽木、腐爛的秸稈等用無菌水浸泡後接種至剛果紅纖維素平板上，28℃培養48～72h，挑選有水解圈者進行濾紙崩解測試，選擇濾紙條崩爛程度較高的菌株進行產酶複篩，最終選出酶活性較高的菌株。
3）毒素的測定：用奧立夫鬆氏法測定分離的菌株是否產毒素。如果發現乙醚與乳劑的接觸麵沒有出現褐色環，表明沒有黴菌毒素存在。可初步鑒定該菌株可以做食品、發酵以及飼料工業生產用菌株。
4）裏氏木黴菌株的鑒定：將上述菌株接種於察氏培養基上，置於25℃培養，肉眼觀察菌落迅速蔓延，形成較薄的菌絲層，菌落初期為白色，平坦，後期因產生分生孢子而呈深綠色。產孢區常排列成同心輪紋狀，菌落背麵無色，有時也呈淺黃色。鏡檢菌絲透明，有隔，細胞壁光滑，分生孢子梗由菌絲直立生成，無色，分枝多，對生或互生二至三級分枝，整體橡樹枝；分枝與分生孢子梗近似直角，末端為小梗，小梗瓶形；分生孢子球形或長橢圓形，表麵粗糙，布滿小刺，單孢，靠黏液在小梗上聚集成球狀綠色的分生孢子頭。據此初步鑒定為裏氏木黴。
7.1.4纖維素酶的生產工藝：真菌、細菌甚至蝸牛與昆蟲都能產生纖維素酶，1960年就是從蝸牛的消化液中首次發現這類酶的。當然現在纖維素酶大多數是利用真菌進行生產的，一般細菌纖維素酶是胞內酶，黴菌纖維素酶是胞外酶。研究較多的黴菌有木黴屬、曲黴屬、毛黴屬。特別是木黴屬中的裏氏木黴、綠色木黴、康氏木黴等是目前公認的、較好的纖維素產生菌（其中C1酶活力較高）。纖維素酶的生產與澱粉酶和蛋白酶等相比，曆史比較短，規模比較小，酶活力也比較低。生產工藝需要進一步研究和完善。
目前，纖維素酶工業生產的方法主要有兩種：即固體發酵和液體深層發酵。無論采用何種工藝，我國纖維素酶生產菌種大多數都采用經誘變或經基因改性的裏氏木黴菌株，也有采用康氏木黴、黑曲黴或者青黴作為生產菌種的。生產原料有麩皮、秸稈粉、廢紙、玉米粉和無機鹽等。
1）固體發酵生產纖維素酶：固體發酵法又稱麩曲發酵法，是以麩皮、米糠、秸稈粉、廢紙等為主要原料，拌入種曲後，裝入盤或簾子上，攤成薄層（厚約1cm），在培養室保持一定溫度和濕度（RH90%～100%）下進行發酵。其主要特點是發酵體係沒有遊離水存在，微生物是在有足夠濕度的固態底物上進行反應，發酵環境接近於自然狀態下的微生物生長習性，發酵後的酶可直接進行幹燥、粉碎得到固體產品。
固體發酵法生產的纖維素酶係更安全，有利於降解天然纖維素，且具有投資少、能耗低、產量高、操作簡單、回收率高、無泡沫、需控參數少、產品價格低廉、環境汙染小等優點。但固體發酵法存在著根本缺陷，即易被雜菌汙染，生產的纖維素酶很難提取、精製，且色素不易去除。目前國內絕大部分纖維素酶生產廠家采用該技術生產纖維素酶時，隻能通過直接幹燥粉碎得到固體配製劑或用水浸泡後壓濾得到液體配製劑，這樣所得產品外觀粗糙，質量不穩定，雜質含量高。此外，國內外生產廠家采用固體發酵法時，對木黴纖維素酶的研究較多，而木黴一方麵毒性嫌疑大，使其應用受到限製；另一方麵普遍存在著β葡聚糖苷酶活力偏低的缺陷，致使纖維二糖積累，影響了酶解效率。近年來，為了最大限度的降低纖維素酶的生產成本，固體發酵工藝引起了更多的重視。
固體發酵過程中的溫度、濕度、時間、水分、pH值等因素及其交互作用對發酵有顯著的影響，對固體發酵而言，溫度是首要因素。培養基及培養條件的優化，是降低成本、提高酶活、實現其工業化生產的重要措施。一般認為，真菌進行固體發酵時最好將培養基的起始pH值調為酸性，這樣有利於真菌的生長而抑製細菌的滋生。固體發酵培養基的初始含水量，應視纖維素材料種類不同而異。玉米秸稈培養基適宜的含水量為1∶（2～2.5）；麥秸培養基的含水量為1∶（1～1.5）；啤酒糟培養基的含水量為1∶1。
2）液體深層發酵法生產纖維素酶：液體深層發酵又稱全麵發酵，是將秸稈等原料粉碎、預處理並滅菌後送至具有攪拌槳葉和通氣係統的密閉發酵罐內，接入菌種，借強大的無菌空氣或自吸的氣流進行充分攪拌，使氣、液麵積盡量加大而進行發酵。液體深層發酵雖然發酵動力消耗大、對設備要求高，但液體深層發酵原料利用率高、生產條件易控製、不易染菌、生產效率高、產品質量穩定、勞動強度小、可大規模、自動化生產，因而是纖維素酶現代工業化生產的主要方式。
液體發酵生產工藝過程是將玉米秸稈粉碎至20目以下進行滅菌處理，然後送發酵罐內發酵，同時接入纖維素酶菌種，發酵時間約為70h，溫度控製低於60℃。從發酵罐底部通入淨化後，無菌空氣對物料進行氣流攪拌，發酵完物料經壓濾機壓濾、超濾濃縮和噴霧幹燥後得到纖維素酶產品。
7.1.5纖維素酶活力的測定：纖維素酶是多組分複合物，纖維素酶作用的底物也比較複雜，纖維素酶各組分的底物專一性也不一樣，而且不同來源的纖維素酶其組成及各組分的比例也有較大的差異，致使纖維素酶活力的測定方法複雜而不統一。國內外曾報道過的纖維素酶活力的測定方法有很多，如濾紙酶活（FPA）測定方法、羧甲基纖維素鈉鹽（CMCNa）酶活性測定方法、濾紙崩潰法、CMC黏度降低法、棉線切斷法、微晶纖維素酶活測定方法、水楊苷酶活測定方法、染色纖維素法、棉花糖法、熒光定糖法等。
纖維素酶係總的糖化能力的測定常見的有3種：一是通過測定熒光物質的熒光強度的大小，來計算其還原糖的含量的熒光法，其主要是根據還原糖與反應液生成熒光物質。二是濾紙酶活（FPA）測定法，纖維素酶係總的糖化能力，通過以濾紙為底物經纖維素酶水解後生成的還原糖的量表征，因為濾紙是聚合度和結晶度都居“中等”的纖維性材料。三是濾紙崩潰法，以濾紙完全崩潰為粉末狀所需的時間來表征纖維素酶的活力，在容器內加入緩衝液和適當稀釋的酶液，放入一定尺寸的濾紙條，在一定溫度條件下反複振蕩。
纖維素酶中的內切葡萄糖苷酶對CMCNa有降解能力，因此內切葡萄糖苷酶活力的表征主要為CMCNa酶活性測定方法。用標準葡萄糖溶液作標準曲線，通過DNS（3，5二硝基水楊酸）法顯色，針對內切葡萄糖苷酶與CMCNa降解生成的葡萄糖等還原糖，以每1min生成相當於1μmol的葡萄糖所需酶量定義為一個酶活性單位，使用分光光度計測其吸光度。
外切葡萄糖苷酶活力的測定有棉花糖化法方法和微晶纖維素酶活測定方法兩種。兩者均采用DNS顯色法，通過計算還原糖的量來表征外切葡萄糖苷酶活力，主要是因為利用纖維素酶能降解微晶纖維素和棉花。
β葡萄糖苷酶活性的測定常用方法有3種：一是將它們衍生為無熒光的底物，因為傘形酮（7羥基香豆素）與4甲基傘形酮具有強烈熒光的特點，使用熒光法進行測定；二是Barush和Swiain法，它以水楊苷作底物，使釋放出來的水楊醇顯色（或DNS顯色），酶解產物用4氨基安替比林作顯色劑，再用分光光度法比色測定；三是以對硝基苯β葡萄糖苷為底物進行酶解，底物水解後釋放出的配基對硝基苯酚可直接在400～420nm波長範圍內測定。
現將纖維素酶活力測定中具有代表性、應用較為廣泛的方法簡介如下：1）濾紙酶活測定法：1984年國際理論和應用化學協會的發酵委員會確定濾紙酶活法為測定纖維素酶活力的標準方法。濾紙為天然結晶類纖維素，以其為底物經纖維素酶水解後生成的還原糖量，表示纖維素酶係總的糖化能力，得到了廣泛的應用。
2）CMC酶活力測定法：以無定形纖維素為底物，以還原糖的生成量表征CMC酶活力，用於測定內切纖維素酶活。如Amano法采用了羧甲基纖維素鈉，國際藥品聯合會提供的測定方法采用了羥乙基纖維素，Merz法采用了磷酸膨脹纖維素。
3）棉線切斷法：采用恒溫振蕩器，將細棉線的一段浸入含有酶液的試管中，在最佳溫度和pH值條件下微振蕩。測定細棉線切斷所需的時間，求得酶活力。
4）濾紙崩潰法：采用恒溫振蕩器，以一定規則的濾紙片為底物，加入裝有酶液的試管中，在最佳溫度和pH值條件下微振蕩。測定濾紙完全崩潰所需要的時間，求得酶活力。由於濾紙崩潰的時間較難確定，所以誤差很大。
在濾紙崩潰法的基礎上又發展了濾紙失重法。即在最佳溫度和pH值條件下，讓濾紙片和酶液反應較長的一段時間（通常需要2周以上），然後將濾紙片水洗烘幹，測定濾紙片反應前後的質量變化，計算出濾紙的失重率，從而推算出酶活力。
5）CMC黏度降低法：測定CMC黏度降低的方法分為旋轉黏度計法和工研法。旋轉黏度法采用旋轉黏度計，測定底物3min和18min的黏度，利用公式推算出酶活力。工研法采用奧氏黏度計，測定底物黏度減至1/2時所需的時間，以10min使底物黏度降低1/2的酶活作為1個活力單位。
6）分光光度計法：酶促反應中生成的糖類物質與顯色劑發生顯色反應，用分光光度計在500mm左右的波長處測定吸光度，換算成還原糖量，計算出酶活力。分光光度計法大大縮短了酶活力測定所需要的時間，而且有較高的精確度，是目前應用最廣泛的方法。國內許多科研機構根據各自的實驗目的，采用了不同的底物和顯色劑，因而由此衍生出的方法更加多樣化。
7）快速測定纖維素酶CMC液化活力法：以鉻礬為交聯劑，使羧甲基纖維素交聯產生黏度較大的凝膠，通過觀測凝膠液化的程度和快慢確定酶活力的大小。此方法簡單方便，目測即可，用於菌種初篩十分方便。
8）平板法：在菌種選育工作中，都希望在平板上對纖維素酶產生菌進行篩選，這樣可大大提高工作效率。磷酸膨脹纖維素易於製成均勻的雙層平板，纖維素酶在其上能夠形成清晰的透明圈，此方法廣泛應用於產纖維素酶的真菌選育中。
9）巴魯阿斯溫測定法：以水楊酸為底物，根據被水解出的水楊醇和βD葡萄糖量，用比色法測定β葡萄糖苷酶活力。此方法普遍應用於β葡萄糖苷酶活力的測定。
纖維素酶活力測定方法的多樣化，使得在選擇具體方法時，必須考慮測定的具體目的。例如，在生化研究中，主要測定纖維素酶單一組分的酶活力，所以必須選擇特定的底物以及緩衝液。在微生物實驗中，主要是篩選產酶菌株和突變菌株，由於測定數量較大，因此可采用較簡單的方法，而不需要很高的準確性。在工業生產實踐中，主要是利用纖維素酶將纖維素轉化為葡萄糖用於工業發酵生產，此時葡萄糖的產量是最重要的指標，因此，可以選擇高純度的底物如濾紙、脫脂棉等。但同時也需要考慮工業生產的巨大工作量，可采用一些較為簡單的方法。
技能操作訓練：固體發酵法生產纖維素酶：1）實訓目標：①掌握固體培養生產纖維素酶的工藝流程：②掌握培養基的配製技術：③掌握纖維素酶粉劑的製備方法。
2）實訓原理及工藝流程：纖維素的固體發酵法是以麩皮、米糠、秸稈等農業廢棄物為主要原料，發酵條件接近於自然狀態下真菌的生長條件的生產纖維素酶的方法。
固體發酵法生產纖維素酶的工藝：A—綠色木黴種子培養罐；B—無菌空氣；C—空氣過濾器；D—接種管；E—排氣管；F—取樣管：G—離心泵；H—自動麩曲培養裝置；I—水噴淋浴；I′—硫酸銨、丙酮、酒精、水；J—輸送帶：K—加料鬥；L—抽提塔；M—儲罐管；N—離心機；O—沉澱罐；P—混合槽；Q—離子交換柱：R—薄膜濃縮器；S—噴霧幹燥器；U—轉動式幹燥器；V—混合器；W—纖維素酶成品；＆—鹽穩定劑3）操作要點：（1）試管斜麵菌種製備：①試管斜麵培養基。馬鈴薯葡聚糖瓊脂（PDA）培養基，121℃下滅菌30min，立即取出擺斜麵。
②接種與培養。在無菌條件下，將保藏的原菌（綠色木黴或裏氏木黴）用接種環接種到斜麵培養基上，在28～30℃恒溫培養箱中增殖培養72h，取出後於0～4℃保存備用。
（2）種子擴大培養：可采用逐級擴大的辦法，先在三角瓶培養基中進行培養，當菌體生長旺盛時可轉入較大容器中培養。根據發酵規模確定采用幾級培養來擴大種子。
①種子培養基製備。種子培養基一般由麩皮、穀糠及無機鹽類等組成，其配方如下：麩皮80%、穀糠20%、（NH4）2SO42%、NaNO30.15%、MgSO4·7H2O0.05%、K2HPO40.05%，自然pH，加水2～3倍原料重，以拌好後用手捏成團但又擠不出水滴為宜。
配製時先計算好各種原料質量並稱出，用少量水將無機鹽類溶化，再將麩皮和穀糠混合均勻，倒入溶好的鹽溶液，攪拌後裝入已滅菌的三角瓶中，每個500mL三角瓶裝麩料40g培養基料，121℃，滅菌30min。