3、2 生物合成方法
3、2、1 組織培養技術利用組織培養技術生產紅景天苷主要體現在紅景天的組織培養上。紅景天組織培養的研究工作主要集中在以下3個方麵：一是對不同種類的組織培養與快速繁殖技術進行研究；二是針對不同的種類、同一種類的不同器官或組織，以及相同外殖體的不同培養階段來篩選理想的培養基配方和培養條件的配置；三是利用組織培養方式來進行相關的其他研究，如探索紅景天苷的生物合成途徑、提高培養組織中紅景天苷的量等。李偉等[15]對狹葉紅景天和大花紅景天不同外植體的組織培養進行了探索，找出了不同外植體在不同培養階段的理想培養基配方和培養條件配置。張瑜等[16]分別以高山紅景天的幼莖和幼葉作為外植體，以MS為基本培養基，研究不同激素配比對高山紅景天愈傷組織的誘導、繼代、生根的影響。結果發現幼莖是最佳的外植體；愈傷組織誘導最佳的培養基為 MS + 6-BA（3 mg·L-1） + NAA（0、5 mg·L-1），誘導率達83、3%；不定芽誘導和增殖的最佳培養基為 MS + 6-BA（2 mg·L-1） + NAA（0、1 mg·L-1），誘導率和增殖率高達72%，且產生的不定芽數量較多；生根培養基以 MS + IAA（0、5 mg·L-1）為最好，生根率為100%，而且幼苗長勢旺盛。張雪蓮等[17]以高山紅景天的種子和試管苗的莖、葉為外植體誘導愈傷組織，繼代培養6次，測定每代愈傷組織中紅景天苷的含量，得出高山紅景天中紅景天苷含量與外植體和繼代次數相關的結論，為培育高紅景天苷植株提供了依據。
3、2、2 細胞培養技術利用細胞培養技術生產紅景天苷主要體現在紅景天細胞的懸浮培養上。艾江寧等[18]研究了高山紅景天懸浮細胞生長和紅景天苷合成動力學特征，發現其懸浮培養的生長周期約為16 d，0～4 d為細胞的延滯期，4～12 d為對數期，13～15 d為穩定期，在第14 d細胞鮮、幹質量達到最大，紅景天苷含量在培養的第12 d達到最高，其質量分數為0、59%。王莉等[19]探索了基本培養基、激素、碳源、氮源等因素對長鞭紅景天細胞生長和紅景天苷產量的影響，確定了長鞭紅景天細胞懸浮培養體係的最適培養條件，即MS培養基+BA（5、0 mg·L-1）+2，4-D（0、1 mg·L-1）+蔗糖（30 g·L-1），建立了高產紅景天苷的細胞懸浮培養體係。魏欣方等[20]在紅景天懸浮細胞培養起始期分別添加苯丙氨酸、肉桂酸和酪氨酸3種前體，結果3種前體在合適的濃度下均能促進細胞中紅景天苷的生物合成，苯丙氨酸的最佳添加質量濃度為20 mg·L-1，肉桂酸和酪氨酸的最佳添加質量濃度均為10 mg·L-1。
3、2、3 生物酶法利用生物酶法合成紅景天苷主要體現在紅景天苷合成的最後一步中，即酪醇與葡萄糖在酶的作用下脫水形成糖苷。以廉價易得的酪醇和β-D-葡萄糖為原料，采用分離純化的糖苷酶或者篩選構建的紅景天苷高轉化菌株合成紅景天苷。Zhang Lei等[21]首次報道了利用微生物酶合成紅景天苷，從黑曲黴MS-48中分離純化一個大小為84、6 kD的糖苷酶Salidrosidase，在p-酪醇質量濃度為15 g·L-1、β-D-葡萄糖質量濃度為60 g·L-1，溫度45、8 ℃，pH 5、0的條件下反應6 h，紅景天苷的產率為10%。Tong等[22]首先利用從蘋果種子粗粉中提取的β-葡萄糖苷酶在二氧六環水混合體係中催化酪醇和β-D-葡萄糖合成了紅景天苷，收率為15、8%。Hiroyuki Akita等[23]從杏仁粗粉中提取的β-葡萄糖苷酶在叔丁醇-水混合係統中分別與7種不同的取代醇反應，合成了一係列紅景天苷類似物，產率適中，在11%～22%。王夢亮等[24-25]從紅景天根係土壤中篩選出了5個菌株，通過比較5個菌株合成紅景天苷的能力，確定米曲黴為合成紅景天苷的出發菌株，以葡萄糖和酪醇為底物合成紅景天苷；利用海藻酸鈉和殼聚糖固定β-葡萄糖苷酶，催化合成紅景天苷，提高了紅景天苷的轉化率。高雪華等[26]采用微生物固體和液體發酵法，通過硫酸銨沉澱法從黑曲黴H35和H42的發酵液中提取合成紅景天苷和酪醇的紅景天苷合成酶係和酪醇合成酶係，通過酶促反應提高了紅景天苷和酪醇的含量。
3、2、4 毛狀根培養毛狀根培養是近10年發展起來的一種新的培養係統，生長速度快、分枝多、弱向地性，有穩定的次生代謝物合成能力，因此可大量培養替代稀缺野生資源。目前，紅景天的毛狀根誘導已取得成功，培養體係也已建立。徐洪偉等[27]利用發根農杆菌A4，R1601，ATCC15834菌株侵染高山紅景天子葉和子葉節誘導獲得毛狀根，並對轉化工程中侵染時間、菌體濃度、共培養時間等參數進行了優化，從而獲得高產量的紅景天苷。胡耀輝等[28]以雙元表達載體pCAM-BIA1301為基礎，用煙草根特異性啟動子TobRB7和葡萄糖基轉移酶基因UGTR分別取代雙元表達載體中的CaMV35S啟動子和GUS基因，從而獲得了煙草根特異性啟動子驅動葡萄糖基轉移酶基因的表達載體，命名為pCA-Tob7：UGTR，並整合到了紅景天發狀根基因組中，為進一步研究特異性啟動子對紅景天苷合成的調控作用奠定了基礎。尿苷二磷酸葡萄糖基轉移酶（UGT）和酪氨酸脫羧酶（TyDC）是紅景天苷生物合成的2個關鍵酶，目前還沒有酪氨酸脫羧酶基因轉入紅景天毛狀根的報道，是一個值得研究的方向。
3、2、5 代謝工程技術利用代謝工程技術生產紅景天苷的前提是分離和鑒定紅景天苷代謝途徑中的功能基因，從而為代謝工程提供候選基因，以及明確代謝途徑中的限速步驟，以便為代謝工程提供理想的作用靶點。近年來有不少研究者在與紅景天苷合成有關基因的克隆與轉化方麵取得了良好的成果。李偉[29]於2003年成功克隆了大花紅景天的苯丙氨酸解氨酶基因；馬蘭青[30]於2005年克隆了高山紅景天的苯丙氨酸解氨酶基因（命名為PALc11）和UDP-葡萄糖基轉移酶基因（命名為UGT1）。Gyrgy[31]於2006年克隆了一個編碼玫瑰紅景天酪氨酸脫羧酶的cDNA片段，根據這個基因在其根和葉中的表達分析，證實了酪氨酸脫羧酶在紅景天苷生物合成中的重要作用。張繼星[32]在2007年成功克隆了高山紅景天的酪氨酸脫羧酶基因（命名為TyrDC1）和UDP-葡萄糖基轉移酶基因（命名為UGT3）。於寒鬆等[33]在2008年成功克隆了高山紅景天糖基轉移酶基因家族裏的3種基因（命名為UGTC1，UGTC2，UGTR），並利用CODEHOP方法克隆了高山紅景天葡萄糖基轉移酶基因cDNA片段。
4 展望
紅景天苷藥用功效顯著，其來源備受世人關注。人工培育紅景天苷高含量的紅景天植物栽培品種所需的生境要求高，勞動成本大，很難滿足日益增長的需求；紅景天苷化學合成過程中摻入化學試劑，應用於食品行業受到很大限製；采用現代生物技術來提高紅景天植株的紅景天苷含量或另外開辟紅景天苷的生物合成途徑成為解決問題的有效方式。紅景苷生物合成研究的不斷深入，以及功能基因組學、代謝組學和生物信息學研究手段的不斷豐富，使得準確闡明紅景天苷整個生物合成途徑的分子機製，並實現其代謝工程的生物合成已不再遙遠。
總之，利用基因工程遺傳改良紅景天屬植物，開展紅景天苷代謝工程研究，進而利用細胞工程生產紅景天苷具有很大優勢。大量的細胞實驗證實利用細胞工程手段生產紅景天苷是可行的，目前需要解決的是工藝參數的優化，而越來越多的分子生物學證據顯示紅景天苷生物合成中起到限製性的因素是酪氨的積累，這可能存在反饋抑製。借鑒前人的研究思路，如獲得酪氨反饋不敏感紅景天突變株，可能會大大提高紅景天苷的含量。因此，利用基因工程、細胞工程結合代謝工程是將來生產紅景天苷的理想途徑，紅景天苷生物合成分子生物學研究、細胞工程研究和代謝工程研究在這方麵將起到決定作用，為最終實現紅景天苷商業化生產奠定基礎。
[參考文獻]
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