中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則
專論
作者：陳士林，姚輝，韓建萍，辛天怡，龐曉慧，石林春，羅焜，宋經元，侯典雲，石上梅，錢忠直
[摘要] 隨著中藥材DNA條形碼分子鑒定方法研究的深入與普及，國家藥典委員會討論通過在《中國藥典》增補本中列入中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則，該指導原則通過對大樣本量中藥材進行DNA條形碼分子鑒定研究，建立以ITS2為核心，psbA-trnH為輔的植物類藥材DNA條形碼鑒定體係和以COI為主、ITS2為輔的動物類藥材DNA條形碼鑒定體係。該文介紹了中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則及其起草說明，並對該原則在中藥材鑒定方麵的應用前景進行展望。
[關鍵詞] 中國藥典； 中藥材；DNA條形碼；分子鑒定；指導原則
曆代本草記載的差異，以及不同醫學流派在傳承過程中產生的異化使得中藥存在同名異物、同物異名等現象；部分藥材由於曆史的沿革，品種產生變遷，形成多基原藥材同用現象；此外，因正品藥材短缺難以滿足市場需求，民間常用其他類似品種取而代之，代用品、習用品的隨意使用使得中藥材品種複雜混亂的情勢加劇。由於傳統的性狀鑒定、顯微鑒定和理化鑒定在中藥材的物種鑒定上有著一定的局限性，為了保證中藥材臨床應用準確、安全、有效，有必要在現有鑒定方法的基礎上增加中藥材DNA條形碼分子鑒定。隨著中藥材DNA條形碼分子鑒定方法研究的深入與普及，國家藥典委員會討論通過在《中國藥典》增補本中列入中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則，該指導原則通過對大樣本量中藥材進行DNA條形碼分子鑒定研究，建立以ITS2為核心，psbA-trnH為輔的植物類藥材DNA條形碼鑒定體係和以COI為主、ITS2為輔的動物類藥材DNA條形碼鑒定體係。本文介紹了中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則及其起草說明，並對該原則在中藥材鑒定方麵的應用前景進行展望，為中藥材準確、可靠鑒定及臨床用藥安全提供新的技術手段。
1 中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則
1.1 定義及原理
DNA條形碼分子鑒定法是利用基因組中一段公認的、相對較短的DNA序列來進行物種鑒定的一種分子生物學技術，是傳統形態鑒別方法的有效補充。由於DNA序列是由腺嘌呤（A）、鳥嘌呤（G）、胞嘧啶（C）、胸腺嘧啶（T）4種堿基以不同順序排列組成，因此一定長度DNA序列能夠區分不同物種。
中藥材DNA條形碼分子鑒定是以ITS2為主體條形碼序列鑒定中藥材的方法體係，其中植物類中藥材選用ITS2為主體序列，psbA-trnH為輔助序列，動物類中藥材采用COI為主體序列，ITS2為輔助序列，符合中藥材鑒定簡單、精確的特點，有明確的判斷標準，能夠實現對中藥材及其基原物種的準確鑒定。本指導原則用於規範中藥材DNA條形碼分子鑒定法，為其應用提供指導。
該鑒定方法主要適用於中藥材（包括藥材、藥材粉末及部分藥材飲片）及基原物種的鑒定。
1.2 方法流程
中藥材DNA條形碼分子鑒定法主要包括供試品處理、DNA提取、PCR擴增、測序、序列拚接及結果判定，以下內容詳細說明各流程中的主要原理及注意事項。
1.2.1 供試品處理 除特殊標明外，藥材使用75%乙醇擦洗表麵後晾幹，稱取10～100 Mg2+備用。
1.2.2 DNA提取 DNA的提取包括破碎細胞壁、釋放DNA，DNA的分離和純化，DNA的濃縮、沉澱與洗滌等基本步驟，目前常用試劑盒法，包括植物基因組DNA提取試劑盒和動物組織/細胞基因組DNA提取試劑盒。
由於植物類中藥材種類繁多，可根據所研究中藥材的具體情況對提取方法加以改進。植物細胞內含有大量次生代謝產物，如多糖、多酚等，這些物質在提取DNA的過程中與DNA共沉澱，形成黏稠的膠狀物難以溶解或產生褐變，嚴重影響DNA提取的產量與質量，以及後續的PCR擴增實驗。β-巰基乙醇是抗氧化劑，在提取DNA過程中加入β-巰基乙醇，可以抑製氧化反應，避免褐化。PVP（聚乙烯吡咯烷酮）是酚的絡合物，能與多酚形成一種不溶的絡合物質，有效去除多酚，減少DNA提取過程中多酚的汙染；同時它也能和多糖結合，有效去除多糖。因此將PVP和β-巰基乙醇配合使用，能夠有效地防止DNA提取過程中多酚及多糖的汙染。EDTA（乙二胺四乙酸）螯合Mg2+2+或Mn2+，抑製DNase（DNA酶）活性；CTAB（十六烷基三甲基溴化銨）是一種陽離子表麵活性劑，可溶解細胞膜，與DNA形成複合物溶於高鹽溶液，降低溶液鹽濃度至一定程度，則從溶液中沉澱，經離心即可將CTAB與DNA複合物同蛋白質、多糖類物質分開。三羥甲基氨基甲烷（Tris-HCl） （pH 8.0）提供一個緩衝環境，防止DNA被破壞。
根、根莖、莖木類、皮類 通常根和根莖組織中多酚、多糖含量高，在研磨時多酚極易氧化成醌類，在純化過程中很難去除，使DNA帶有一定顏色，影響後續的PCR反應，所以在提取根及根莖類藥材DNA時一定要注意多糖、多酚的去除。提取根及根莖類藥材DNA時水浴時間一般為90 min，對於質地堅硬的根及根莖類和莖木類藥材，可以采用延長水浴時間，如56 ℃水浴過夜，使得DNA充分釋放到緩衝溶液中。此外，根莖類藥材由於富含纖維和貯藏物質，需較多樣品量才能提取到足量DNA，可用大體積離心管（5 mL或15 mL）抽提。皮類中藥材組織中富含薄壁組織和纖維等，加液氮不易研磨成細粉，需適當增加樣品量，同時應增加β-巰基乙醇和PVP的使用量。
葉、花、全草類 該類藥材采用試劑盒一般都能成功提取其DNA，對於保存時間較久的葉、花、全草類藥材可適當增加水浴時間，同時適當降低水浴溫度，如56 ℃水浴過夜等。
果實、種子類 果實及種子類中藥材中多富含油脂，研磨時易被氧化，且易粘著在研缽壁上，損失較大，提取時需增加樣品量。另外，對研磨後的材料可用丙酮浸提，去除脂溶性酚類化合物。
動物藥材 常用基於SDS（十二烷基硫酸鈉）原理的試劑盒法提取DNA。SDS是一種陰離子表麵活性劑，在55～65 ℃條件下能裂解細胞，釋放出核酸。對肌肉類動物藥材如海龍、蛇類、蛤蚧等，需進行紫外殺菌處理，並且需要充分磨碎；含有脂類較多的動物內髒器官如蛤蟆油，先用不含蛋白酶K和SDS的緩衝液浸泡藥材，然後在試劑盒消化緩衝液中增加SDS含量，有利於脫去脂類；骨甲類藥材如龜甲、鱉甲和鹿茸等，由於DNA含量較低，樣品量要適當增大，也可用大體積離心管（5 mL或15 mL）抽提。
1.2.3 PCR擴增 植物類中藥材及其基原物種擴增ITS2或psbA-trnH序列，動物類中藥材及其基原物種擴增COI序列，通用引物及擴增條件如下，具體如有改變見各藥材項下。
ITS2序列擴增正向引物ITS2F：5′-ATGCGATACTTGGTGTGAAT-3′；反向引物ITS3R：5′-GACGCTTCTCCAGACTACAAT-3′。psbA-trnH序列擴增正向引物psbAF：5′-GTTATGCATGAACGTAATGCTC-3′；反向引物trnHR：5′-CGCGCATGGTGGATTCACAATCC-3′。COI序列擴增正向引物HCO2198：5′-TAAACTTTCAGGGTGACCAAAAAATCA-3′；反向引物LCO1490：5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′。
PCR反應體係以25 μL為參照，包括 1× PCR緩衝液（不含Mg2+Cl2），2.0 mmol·L-1 Mg2+Cl2，0.2 mmol·L-1 dNTPs，0.1 mmol·L-1引物對，模板DNA，1.0 U Taq DNA聚合酶，加滅菌雙蒸水至25 μL。設置未加模板DNA的PCR反應為陰性對照。
ITS2序列擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 45 s，40個循環；72 ℃ 10 min。psbA-trnH序列擴增程序：94 ℃ 5 min；94 ℃ 1 min，55 ℃ 1 min，72 ℃ 1.5 min，30個循環；72 ℃ 7 min。COI序列擴增程序：94 ℃ 1 min；94 ℃ 1 min，45 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1.5 min，5個循環；94 ℃ 1 min，50 ℃ 1.5 min，72 ℃ 1 min，35個循環；72 ℃ 5 min。
1.2.4 PCR產物檢測 采取瓊脂糖凝膠電泳方法檢測PCR產物。電泳後，PCR產物應在相應的DNA條形碼序列長度位置出現一條目的條帶，陰性對照應無條帶。
1.2.5 測序 有PCR擴增條帶的樣品送測序公司進行DNA序列測定。使用DNA測序儀對目的條帶進行雙向測序，PCR擴增引物作為測序引物，測序原理同Sanger測序法。
1.2.6 中藥材DNA條形碼序列獲得 主要包括序列拚接和序列質量與方向2個方麵的內容。對雙向測序峰圖應用專業軟件進行序列拚接，去除引物區，獲得相應的DNA序列。為確保DNA條形碼序列的可靠性，需對測序質量進行評估，去除測序結果兩端的低質量序列。序列方向應與PCR擴增正向引物方向一致。
1.2.7 結果判定 將獲得的序列在中藥材DNA條形碼鑒定係統或GenBank數據庫中應用BLAST（basic local alignment search tool）方法進行結果判定，結果中相似性最高的序列對應物種為查詢序列最接近的物種。如果植物類藥材ITS2序列比對後最接近的物種為真菌，則需采用psbA-trnH序列重複上述方法流程。中藥材DNA條形碼鑒定數據庫係統及GenBank數據庫BLAST鑒定係統操作流程見下。
登錄中藥材DNA條形碼鑒定數據庫係統網站，在主頁點擊“物種鑒定”。根據需鑒定物種的種類，選擇對應的鑒定數據庫，如點擊植物類藥材鑒定（ITS/ITS2）。將需要鑒定的物種序列複製後粘貼到“植物類藥材鑒定（ITS/ITS2）”的序列輸入欄，點擊“提交”按鈕，進行BLAST鑒定。在BLAST比對結果中，在“序列比對信息”欄查看相關比對信息，在“物種鑒定結果”欄顯示與所查詢序列最接近的物種。
登錄GenBank數據庫BLAST鑒定係統，在Basic BLAST中選擇nucleotide blast，在Enter Query Sequence中粘貼需要鑒定的序列（Query）（建議用fasta格式）。在Choose Search Set中選others（nr etc.）數據庫，點擊左下角BLAST。在BLAST結果中查看序列相似性最高（max ident）的物種，一般為與查詢序列最接近的物種。
1.3 中藥材DNA 條形碼數據庫構建原則
建立中藥材DNA條形碼數據庫時，應在藥材原產地及主產地采集供試品，采用經典分類方法確定其基原，采集樣本盡可能覆蓋其分布區，每個物種采集來自不同產地樣本20份以上。根據具體藥材測定ITS2或psbA-trnH或COI等DNA條形碼序列，分析確定該藥材DNA條形碼序列種內變異大小。對實驗獲得或GenBank中的中藥材DNA條形碼序列必須經過核準後方可錄入中藥材DNA條形碼數據庫，同時需定期對數據庫進行更新。
1.4 方法學驗證
1.4.1 影響因素考察 考察DNA條形碼分子鑒定法的影響因素，包括DNA提取（樣品量、水浴溫度和水浴時間）、PCR條件（變性時間、退火溫度與時間及延伸時間）及產物純化（考察不同純化試劑盒），保證實驗方法的準確性。
1.4.2 精密度考察 主要分為重複性考察、中間精密度考察及重現性考察。
重複性，至少用3批供試品，每批3次或同批供試品進行6次測定試驗後對結果進行評價。實驗結果判定應基本一致。
中間精密度，考察實驗室內部條件改變（如不同人員、不同儀器、不同工作日和實驗時間）對測定結果的影響，至少應對同實驗室不同操作人員的結果進行考察。
重現性，實驗結果在3家以上實驗室能夠重現，相同樣品在不同實驗室獲得DNA條形碼序列應相同。
1.4.3 方法適用性考察 采用DNA條形碼分子鑒定法對20批次以上藥材或基原物種進行測定，積累數據，確定種內序列變異大小，保證該測定方法的適用性。
1.4.4 基原物種對比驗證 以分類學家確認的基原物種葉片為對象，采用該方法獲得DNA條形碼數據，與相應藥材產生的DNA條形碼數據進行對比，避免內生真菌等汙染，保證結果準確性。
1.5 注意事項
實驗場所應具備分子生物學實驗室的基本條件。
為防止外源真菌汙染，實驗前須將實驗用具進行高壓滅菌，並用75%乙醇擦洗藥材表麵。有些藥材本身含有內生真菌，如果內生真菌存在於藥材的外圍組織，則選用內部組織進行實驗。如果真菌遍布整個藥材，植物類藥材需選用psbA-trnH條形碼（真菌內不含有該基因片段），不能選用ITS2序列。為進一步確保實驗結果不被真菌汙染，研究者可參考GenBank數據庫辨別是否為真菌序列。
中藥材DNA條形碼分子鑒定法不用於確定藥用部位，暫不用於混合物及炮製品的鑒定。DNA條形碼分子鑒定是利用通用DNA序列來進行物種鑒定，因此該方法可鑒定藥材的基原物種，而不能確定藥用部位。
種內閾值的確定。同一物種的不同樣品間存在一定的變異範圍，即種內變異閾值。不同物種，不同條形碼序列均會影響種內變異範圍。各基原物種的種內變異範圍（種內遺傳距離閾值）會在藥材品種中具體明確。
2 中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則起草說明
中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則在大量實驗樣本基礎上形成，實驗涉及的樣本量如下。
在2 373份藥材樣品中進行了DNA提取和DNA條形碼序列ITS/ITS2及psbA-trnH的PCR擴增，其中包括根及根莖類藥材381個樣品（來自26科47屬58種），全草類藥材1 679個樣品（來自142科482屬912種），花類藥材70個樣品（來自10科16屬22種），莖木類藥材52個樣品（來自16科20屬24種），果實類藥材90個樣品（來自16科20屬33種），種子類藥材18個樣品（來自8科11屬11種），皮類藥材20個樣品（來自6科6屬6種），真菌類藥材63個樣品（來自3科3屬4種）。
中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則用於規範中藥材DNA條形碼分子鑒定法，為其應用提供指導。中藥材DNA條形碼分子鑒定法主要包括核心條形碼序列選擇、DNA提取、PCR擴增、電泳、測序、序列拚接及結果判定等步驟。中藥材DNA條形碼分子鑒定指導原則起草說明具體如下。
2.1 中藥材DNA條形碼分子鑒定核心序列選擇依據
2.1.1 植物類中藥材ITS2和psbA-trnH條形碼的選擇依據 DNA條形碼研究的首要任務是確定通用DNA條形碼序列。在植物界，研究者主要從葉綠體基因組和核基因組中尋找理想的DNA條形碼，曾提出諸多候選條形碼序列或組合[1-9]。2009年，國際條形碼協會植物工作組對來自550個物種907個樣品的7個序列（rbcL，matK，rpoC1，ropB，psbA-trnH，psbK-psbI，atpF-atpH）進行了分析比較，建議將rbcL+matK組合作為植物通用條形碼[10]。然而，植物工作組認為該組合還遠不夠完美，尋找植物DNA條形碼的工作還沒有結束[11]。同年，在墨西哥召開的第三屆國際條形碼大會上，與會代表一致認為應對ITS/ITS2和psbA-trnH序列進行進一步評估。
2010年，陳士林等[12]分析比較了7個候選DNA條形碼（psbA-trnH， matK， rbcL， rpoC1， ycf5， ITS2， ITS）。研究對象為藥用植物及其密切相關物種。研究結果表明ITS2表現突出，在物種水平的鑒定效率高達92.7%。因此，陳士林等建議將ITS2作為藥用植物標準DNA條形碼。鑒於研究中psbA-trnH僅次於ITS2序列，也具有較好鑒定能力，因而推薦其作為ITS2的輔助條形碼。Yao等[13]基於大樣本量分析證實ITS2序列可以作為植物物種鑒別的通用條形碼，並以ITS2序列為基礎初步建立了藥用植物DNA條形碼數據庫網絡查詢係統（http：//its2-plantidit.dnsalias.org/）。2011年，中國植物條形碼工作組（Chinese Plant BOL Group） 對來自42目75科141屬1 757物種的6 286樣本的rbcL，matK，psbA-trnH，ITS序列進行研究，其結果進一步驗證了ITS2的鑒定能力，建議ITS/ITS2應成為種子植物的核心條形碼，當ITS難以擴增和測序時，ITS2可以有效地彌補該缺陷[14]。陳士林等[15]提出建立以ITS2為核心、psbA-trnH為補充序列的植物類藥材DNA條形碼鑒定體係。
2.1.2 動物類中藥材COI和ITS2條形碼的選擇依據 在動物界，Herbert等於2003年首次提出將一段長度約為650 bp的COI基因序列作為動物條形碼鑒定的基礎片段[16]。同年，Herbert等[17]對11門13 320個物種的線粒體細胞色素c氧化酶亞基I （cytochrome c oxidase subunit I， COI）基因序列進行比較分析，結果表明所研究物種的種間遺傳距離在0.0%～53.7%，物種種間遺傳距離平均可達到11.3%，79%的物種種間遺傳距離均大於8%。以上研究結果進一步支撐了前期的結論。隨後，COI基因特定片段的鑒定能力在鳥類、魚類、節肢動物、哺乳動物等具體動物類群的鑒定研究中均獲得了印證，因此研究者一致建議將COI序列作為動物的通用條形碼[18-27]。
2010年，陳士林等[12]推薦將ITS2作為藥用植物通用條形碼，同時研究表明ITS2序列在動物鑒定中也有較好表現[28-30]。為進一步評估ITS2序列對動物物種的鑒定能力，Yao等[13]對GenBank中12 221條動物ITS2序列進行了分析，結果表明ITS2序列在物種水平和屬水平的鑒定成功率分別為91.7%，99.7%。此外，研究表明ITS2序列對動物密切相關物種也具有較高的鑒定能力，COI序列能夠成功鑒定大多數動物類群，但刺胞動物[17]、West Palaearctic Pandasyopthalmus[31]等動物類群的COI基因序列變異性小或不變。而且線粒體DNA是母係遺傳，應用其進行物種鑒定時應考慮核DNA，形態或生態特征[32]等方麵的數據。Yao等基於較大樣本量的研究表明ITS2序列對動物物種的鑒定成功率高達91.7%，且在刺胞動物中的鑒定成功率大於77%，鑒於ITS2對動物具有較高的鑒定能力，Yao等建議將其作為COI序列的輔助序列對動物物種進行鑒定[13]。