腸道菌群對中藥糖苷類成分脫糖基代謝的研究進展
綜述
作者：張聖潔 郭錦瑞 康安 狄留慶
[摘要]中藥糖苷類成分是中藥中一類重要的活性物質，其藥理活性、藥代動力學特征及體內存在是目前研究的熱點。糖苷類成分在生物體內代謝轉化途徑主要是由腸道菌群介導的脫糖基代謝，生成苷元後更易吸收入血並發揮藥效。該文基於腸道菌群在中藥糖苷類成分體內代謝及藥效發揮中的重要作用，綜述了腸道菌群中代謝中藥糖苷類成分的主要糖苷酶，產生糖苷酶的主要菌屬，以及代表性糖苷類成分的脫糖基代謝途徑。並針對腸道菌群對中藥糖苷類成分代謝研究過程中存在的問題進行了初步探討。
[關鍵詞]腸道菌群；中藥糖苷類成分；脫糖基代謝
近年來，中藥糖苷類成分因其突出的藥效活性而受到國內外學者的廣泛關注。藥代動力學研究表明，糖苷類成分在腸道較難吸收，其生物利用度低、腸內滯留時間較長、藥理活性相對較小，在人體內難以直接發揮藥效作用，因此，絕大多數糖苷類化合物需經腸道菌群酶解為苷元而發揮療效。本文對代表性糖苷類成分的脫糖基代謝途徑、腸道菌群中的代謝酶以及相關的腸道菌屬進行了綜述，並對相關研究方法做了介紹，以期為中藥糖苷類成分的深入研究提供參考。
1 糖苷類成分在胃腸道中的代謝轉化
中藥糖苷類成分在胃腸道中的代謝轉化可分為以下幾個過程：①糖苷鍵在酸性環境下較易水解，因此部分中藥糖苷類成分在胃液的酸性環境下可部分水解為苷元，進而在胃中吸收或進一步經胃排空進入腸道。②小腸壁是藥物吸收的主要部位，在小腸黏膜層中的上皮細胞及腸道菌群表達有葡萄糖苷酶、葡萄糖醛酸化酶、硫酸化酶和甲基化酶等代謝酶，糖苷類化合物可在此發生糖苷鍵的水解生成苷元，苷元可被吸收入血或發生Ⅱ相代謝，其中Ⅱ相代謝產物可通過肝腸循環再一次進入腸道進行二次吸收。③未被小腸吸收的原型成分及一部分Ⅱ相代謝產物進入結腸。結腸中的腸道菌數目比胃和小腸中分別約高7和11個數量級。腸道菌群中的相關酶係主要使藥物的的水解和裂環降解而代謝。
1.1 黃芩苷 黃芩苷是黃芩素的7-O-葡萄糖醛酸結合物，為黃芩的主要有效成分，屬於黃酮類化合物，具有顯著的生物活性，臨床上主要用於抗菌消炎和抗感染。多數研究表明黃芩苷與其他黃酮類化合物類似，都存在吸收差的問題，並認為黃芩苷主要通過腸道菌群水解為黃芩素後被吸收。黃芩苷經過人體腸道菌群代謝後產物主要為黃芩素和甲基化苷元6OCH3，黃芩素（木蝴蝶素A）。研究還發現這2種代謝產物能通過抗組胺作用改善小鼠的瘙癢反應，並且作用強於黃芩苷[1，2]。
1.2 芒果苷 芒果苷為芒果葉的主要活性成分，是一種四羥基吡酮的碳糖苷。具有抑製中樞神經、抗炎、抑菌、抗單純皰疹病毒，利膽和免疫作用，對模擬高原急性低氧肝損傷有保護作用。Sanugul[3]和Braune[4]從人體腸道菌群分別分離出細菌Bacteroides sp. MANG和CG19，1，證明了芒果苷可被腸道菌群水解為苷元notathyriol。由於芒果苷的糖苷鍵有別於一般的氧苷鍵，為化學性質更穩定的碳苷鍵，所以普通的β-葡萄糖苷酶和α-葡萄糖苷酶無法破壞其穩定的碳苷鍵，而需要由芒果苷自身誘導細菌產生相應的酶促使其水解形成苷元[5]。
1.3 人參皂苷 人參中皂苷類活性成分已分離和鑒定的達30多種[6]。早期研究證明，人參皂苷類在肝髒內基本不代謝，主要在腸道中降解。腸道中Bifidobacterium K506，Eubacterium A-44，Prevotellaoris，Fusobacterium K，60[7]和Paecilomyces Bainier sp.等細菌通過協同作用共同參與人參皂苷成分代謝。原人參二醇型皂苷人參皂苷Rb2在腸道菌群作用下主要代謝途徑為人參皂苷Rb1→人參皂苷Rd→人參皂苷F2→Compound K→20（S），原人參二醇[8，9]。人參皂苷Re在人體腸道菌群作用下主要生成人參皂苷Rh2和F2，較少生成人參皂苷Rg2和20（S），原人參三醇[10]。人參皂苷在體內被代謝成為稀有人參皂苷，它們可能是人參在體內發揮藥效作用的活性物質。
1.4 京尼平苷 京尼平苷屬於環烯醚萜苷類化合物，是梔子中的主要活性成分，現代藥理學表明，京尼平苷具有利膽、抗炎、鎮痛等作用。Yukio Kawata[11]篩選健康人體新鮮糞便中的25種細菌，在京尼平苷和NH4Cl存在下厭氧環境中培養，反應後經分析，確定產物中含有京尼平及含氮代謝物genipinine，說明京尼平苷類化合物在腸道菌群作用下會分解為活性物質苷元。Teruaki Akao等[12]研究發現京尼平苷水解成苷元後被腸道菌群和動物體內存在的酯酶代謝成京尼平苷酸苷元。利用人體腸道中雙歧杆菌HY8001和脆弱擬杆菌分別與京尼平苷共同孵育研究對HepG2細胞毒性，結果顯示代謝產物京尼平可能會產生更強細胞毒性[13]。
1.5 番瀉苷 番瀉葉的主要活性成分為番瀉苷A，B，C，D。研究發現番瀉苷有2條腸道菌群代謝途徑：β，D-葡萄糖苷酶將番瀉苷水解成番瀉苷元，然後通過還原反應降解生成藥理活性最強的大黃酸蒽酮。番瀉苷首先被還原成8，葡糖基，大黃酸蒽酮，再被β，D-葡萄糖苷酶水解生成大黃酸蒽酮。參與番瀉苷水解的菌屬有Bifidobacterium sp.SEN， Clostridium sphenoides， B. adolescentis， C. Sphenoides等[14]。有研究發現甘草中的甘草苷、芹糖甘草苷能加速番瀉苷A的代謝能力，增強瀉下的作用[15]。
2 腸道菌群中的主要酶係
腸道細菌中有介導糖苷類成分代謝的多種酶，其中起主要作用的是糖苷酶，包括α-鼠李糖苷酶、β-葡萄糖苷酶、β-葡萄糖醛酸苷酶、β-木糖苷酶等，它們共同參與各種糖苷鍵的水解。糖苷酶的活性中心由2個羧基殘基組成。其催化作用是通過與糖苷化合物的異頭碳形成正碳離子中間體，然後離去完成反應。糖苷鍵的催化機製通常有2種：倒置（inverting）和保持（remaining）方式[16]。根據糖苷的苷元結構、結合的糖基種類以及糖基連接到苷元上的位置不同[17]，對其產生水解作用的糖苷酶也不同。此外，還包含硝基還原酶、偶氮還原酶以及脲酶等協同參與糖苷類成分的代謝。
2.1 β，D-葡萄糖苷酶 β，D-葡萄糖苷酶（β，D-glucosidase）是糖苷類成分水解的常見酶，主要分布在小腸上皮絨毛膜刷狀沿及結腸的腸道菌群上。β，D-葡萄糖苷酶為酸性蛋白，等電點在酸性範圍，其能水解結合於末端非還原性的β，D-葡萄糖苷鍵，同時釋放出β，D-葡萄糖和相應的配基。β，D-葡萄糖苷酶對底物的糖基部分結構的專一性較差。能裂解C，O糖苷鍵、C，S鍵、C，N鍵、C，F鍵等；有些對糖基部分的C和C構形也不專一，能同時水解β-葡萄糖苷酶鍵和β-半乳糖苷鍵，有些甚至C位的專一性也不高，能水解木糖。β，D-葡萄糖苷酶參與糖酵解途徑，是參與雙歧杆菌糖代謝的有關酶係之一[18]。大多數雙歧杆菌和多形擬杆菌對β-葡萄糖苷酶有較高的表達。
2.2 β，D-葡萄糖醛酸苷酶 某些腸杆菌科中的β，D-葡萄糖醛酸苷酶（β，D-glucuronidase）以四聚體形式存在，酶學性質十分穩定，在環境條件變化較大的情況下仍然具有活性。有研究表明[19]，腸道菌群中β，D-葡萄糖醛酸苷酶活性的表達隻在一些梭菌聚集的厚壁菌內。不同組織部位的理化及生物特性相似，pH 3.6～5.8時具有最大催化活性。β，D-葡萄糖醛酸苷酶可以從糖苷鏈上非還原的聚多糖端裂解β，D-葡萄糖醛酸殘基，催化各種類型的β，D-葡萄糖醛酸苷水解。該酶為參與Ⅱ相代謝反應的重要酶係。一些黃酮類成分在腸道內被Ⅱ相代謝酶（UGT）催化後產生葡萄糖醛酸苷，這些Ⅱ相代謝產物一般通過尿、膽汁排出體外。當膽汁排到腸道中後，會被腸道菌群中β，D-葡萄糖醛酸苷酶水解釋放苷元，而後被重吸收，此過程即為“肝腸循環”[20，21]。β，D-葡萄糖醛酸苷酶能維持機體正常的生理活動，缺乏此酶會表現出黏多糖貯積症VII型等症狀。
2.3 α，L-鼠李糖苷酶 α，L-鼠李糖苷酶（α，L-rhamnosidase）主要存在於細菌、真菌、動物肝髒中。α，L-鼠李糖苷酶的最適pH為4～7，可以催化水解非還原性末端L-鼠李糖殘基α連接的糖苷鍵，如α-1，2，α-1，3，α，1，4，α-1，6，α1連接的不同糖苷鍵。不同來源的α，L-鼠李糖苷酶能水解不同連接形式的糖苷鍵，如槲皮苷、柚皮苷、人參皂苷Rg2、柴胡皂苷C等中藥糖苷類成分中的糖苷鍵。
2.4 β，D-木糖苷酶 β，D-木糖苷酶（β，D-xylosidase）在自然界中分布廣泛，現已從細菌、放線菌和真菌（包括酵母）等微生物和高等植物中分離得到。β，D-木糖苷酶的等電點多數為弱酸性，最適pH一般在3.0～5.0。β，D-木糖苷酶是一種外切酶，主要催化水解木糖苷，並以外切方式從非還原性末端水解木二糖及木二糖以上的低聚木糖，水解產物為木糖。有研究[22]將B. breve K，110中編碼β，D-木糖苷酶的基因克隆後並在大腸杆菌中獲得高效表達，能將人參皂苷Ra1水解為人參皂苷Rb2。β，D-木糖苷酶可作用於萜類、甾體等苷元與木糖形成的糖苷鍵，釋放出苷元。
2.5 β-半乳糖苷酶 β-半乳糖苷酶（β-galactosidase）能催化乳糖水解生成葡萄糖和半乳糖，還可以催化半乳糖基轉移反應，生成低聚半乳糖[23]。β-半乳糖苷酶的活性與腸道菌群組成緊密相關，腸道菌群益生菌占優勢時其活性越高。研究證明，β-半乳糖苷酶由雙歧杆菌、乳酸菌和嗜熱鏈球菌等益生菌大量產生，其酶活力的變化可為腸道微生態環境的改善提供指示作用[24]。
2.6 硝基還原酶 硝基還原酶（nitroreductase）是依賴於NAD（P）H的黃素酶，能還原硝基基團成為經胺或氨基，催化硝基芳香化合物為芳香胺的還原反應的酶。代謝產物可作為細菌生長的氮源。硝基還原酶的基因在細菌的基因內廣泛分布，包括革蘭陰性菌和陽性菌、胞內共生菌、病原體和和活組織、厭氧菌等[25]。
2.7 偶氮還原酶 偶氮還原酶（azoreductase）屬黃素蛋白酶類，可將偶氮聚合物的偶氮雙鍵（，NN，）還原裂解成芳香胺類物質，偶氮還原酶以NADPH或NADH為輔酶，對氧很敏感，有氧時喪失活性，除去氧後又可恢複活性。在人的腸道中可分離得到具有偶氮還原活性的厭氧細菌有產氣莢膜梭菌和腸道糞球菌[26]。
3 腸道菌群中的表達糖苷酶的主要菌屬
大部分在體內發揮作用的腸道菌群為益生菌，其作用機製主要有以下幾種：通過增強消化、能量獲取、維生素的產生提高宿主的營養吸收；通過在腸道黏膜與致病菌競爭營養和黏附受體加強腸道屏障功能，抵抗腸毒性刺激宿主免疫功能；刺激腸上皮細胞增殖，提高機體恢複功能[27]。Patrizia等[28]給予腸易激綜合症或功能性腹瀉的患者口服益生菌製劑VSL，3，觀察腸道菌群的變化情況。結果顯示乳酸杆菌、雙歧杆菌和嗜熱鏈球菌數目明顯增多，而腸球菌、大腸菌、擬杆菌以及產氣莢膜杆菌沒有顯著改變。同時糞便中的β-半乳糖苷酶活性增加而脲酶活性降低。說明微生態製劑可以對疾病引起的菌群失調進行一定的調節作用。
3.1 乳酸杆菌 乳酸杆菌Lactobacillus是一群杆狀或球狀的革蘭陽性細菌，負擔著人體內重要的生理功能。有研究表明乳酸杆菌及其產物的存在能夠降低腸道菌群中一些酶活性包括β-葡萄糖醛酸苷酶[29]、硝基還原酶和偶氮還原酶。口服乳酸杆菌會減少大腸杆菌以及厭氧菌的數量。其中嗜酸乳杆菌L. acidophilus菌屬顯示出對β-半乳糖苷酶的高表達[30]。一旦腸道中乳酸杆菌的數量減少，就會出現菌群失調，進而可能導致疾病的發生；相反隻要腸道中乳酸杆菌的數量增加，區係得到平衡，就可以促進機體健康並治療某種疾病。
3.2 雙歧杆菌 雙歧杆菌Bifidobacterium是一種腸道內厭氧的革蘭陽性菌，是人和動物腸道的重要生理性益生菌，易受氧氣、pH、溫度條件影響而死亡。雙歧杆菌能夠產生多種糖苷酶如α或β-半乳糖苷酶、α或β-葡萄糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶、甘露糖苷酶、D-木聚糖苷酶、D-木糖異構酶等[31]。嬰幼兒雙歧杆菌數量占約腸內細菌總量的25%；隨著年齡的增大，雙歧杆菌逐漸減少甚至消失，65歲以上的老人，雙歧杆菌數量則減少到僅占7.9%。補充一定數量的雙歧杆菌有助於調整腸道功能紊亂提高人體免疫力，抑製病原菌生長，抗炎，抗衰老[32]。
3.3 嗜熱鏈球菌 嗜熱鏈球菌Streptococcus thermophilus是一種耗氧的革蘭陽性菌，以2個卵圓型為一對的球菌連成約0.7～0.9 μm的長鏈。這種細菌隻能到達小腸的上半部，不像雙歧杆菌可以進入大腸。能產生β-半乳糖苷酶，可以促進乳糖的消化[33]。可作為潛在有益菌，具有健康效果、轉運活性和一定的腸道黏附性。
3.4 多形擬杆菌 多形擬杆菌（Bacteroides thetaiotaomicron）是人體中數量最大的細菌之一，具有巨大的降解難被宿主消化多糖（如纖維素、木聚糖、果膠）的能力。多形擬杆菌基因組與其他常見的微生物基因組（大腸埃希菌、長雙歧杆菌、產氣莢膜梭菌）相比包含糖基水解酶最多。除一些常見的β-葡萄糖苷酶、β-半乳糖苷酶、β-呋喃果糖苷酶等，擬杆菌還能表達一些專有酶包括β-甘露糖苷酶、α-鼠李糖苷酶、α-甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶[34]、殼多糖酶。當宿主的飲食或體內環境發生變化時，多形擬杆菌能迅速調節自身的基因組，維持腸道環境的穩定[35]。
3.5 大腸杆菌 大腸杆菌Escherichia coli為異養厭氧型革蘭氏陰性短杆菌，是人和動物腸道中正常棲居菌，一般情況下不致病，但它是條件致病菌。α或β-葡萄糖苷酶、α或β-半乳糖苷酶以及β-葡萄糖醛酸苷酶等可以在大部分大腸杆菌中高效表達[36]。已發現的大腸杆菌的F因子、R因子和Col因子等質粒在分子生物學和遺傳工程中經常作為外源基因的載體[37，38]（表1）。
4 相關實驗技術
研究腸道菌群介導的脫糖基代謝時所涉及的實驗技術包括脫糖基代謝產物的結構鑒定、腸道菌群中各糖苷酶的活性，體外溫孵係統，介導脫糖基代謝的菌屬。
脫糖基代謝產物結構鑒定的方法主要有LC，MS/MS，LC，Q，TOF/MS等技術，根據質譜給出的分子量或準確分子量信息，結合碎片離子信息，綜合原型藥物的碎裂規律，預測其形成的代謝產物的結構和分子量，推測代謝途徑。
根據糖苷類成分結構中的糖苷鍵的連接位置，糖基的結構來確定相應的糖苷酶。腸道菌群中各糖苷酶活性的測定普遍采用以對硝基苯吡喃葡萄糖苷為底物的比色法[56，57]，底物水解後釋放出的對硝基苯酚在400～420 nm有特征吸收峰，可直接在400～420 nm比色測定。該酶促反應需考慮底物濃度、最適溫度、反應時間、pH等因素的影響。
糖苷酶表達依賴於腸道中一些介導脫糖基代謝的菌屬，包括乳酸杆菌、雙歧杆菌、梭杆菌、鏈球菌和產氣莢膜梭菌等[58]。對菌株的研究方法包括純化培養、實時定量PCR和PCR，DGGE等分子生物學技術並結合糖苷酶的活性來進行研究。
采用體外溫孵係統可以在短時間內得到大量的代謝產物，迅速解決一些複雜的藥物代謝研究中的問題，同時可以比較方便地控製某些代謝條件，代謝體係比較純淨，易於對代謝物進行分離、提取，盡快確定藥物代謝途徑及結構變化情況，尤其在代謝產物的結構確定方麵具有突出的優越性。體外腸內菌群代謝的研究方法有糞便溫孵法、單一菌種溫孵法、腸菌酶法等。選擇不同糖苷酶抑製劑加入到孵育環境中，可以用來抑製相應酶活性，比較代謝產物的不同，從而檢測能夠介導中藥糖苷類成分脫糖基代謝的酶。
5 展望
近年來，研究表明多種疾病均能導致腸道菌群的失調，如抑鬱、糖尿病、肥胖、高脂血症等，此外同時隨著醫療事業的發展，抗生素濫用也嚴重抑製了人體內正常腸道菌群的生長，使腸道菌群失去平衡，不能正常分泌各種糖苷酶，因此不能有效地對攝入人體後的糖苷類成分進行分解代謝成活性代謝產物，最終達不到相應的療效。同時由於腸道菌群本身的個體差異也導致了糖苷類中藥在人體內吸收的差異。因此為了提高中藥苷類成分的生物利用度，可從腸道生理狀態的腸道菌群的生物活性入手，鑒別出具有生物轉化天然苷類活性的特異性腸道細菌菌屬和菌株，將之與天然苷類同時攝入，有助於將苷轉化為苷元，消除苷類中藥應用的個體差異，提高糖苷類成分的生物利用度，進而提高藥效。此外還可通過攝入一些益生元，調節腸道菌群，進而間接的提高中藥糖苷類成分的生物利用度。