7月，孫中山到日本，主張聯合各革命團體，組織中國同盟會，陳天華積極讚成。8月，中國同盟會成立，他任秘書，並被推為會章起草人之一。《二十世紀之支那》改為同盟會的機關報《民報》後，他在《民報》上先後發表不少文章和政治小說《獅子吼》。同年11月，日本文部省頒布歧視並限製中國留學生的《清國留學生取締規則》，留日學生發動了抵製這個規則的強大運動。為了激勵人心，陳天華在12月7日留下《絕命書》萬餘字，次日投海自殺。著作輯為《陳天華集》。
陳天華的死，在當時就引起了很大的轟動。1906年的春天，當陳天華的靈柩運回上海後，中國公學為他和另一位投黃浦江自盡的同盟會員姚宏業舉行了一次公葬的會議，到會千餘人，會上宣讀了姚宏業的遺書和陳天華的絕命辭，大家痛哭流涕，會議決定將陳姚靈柩一起送回家鄉湖南，舉行公葬。
影響評價
陳天華的文章，旨在揭露帝國主義侵略，痛斥清朝政府是“洋人朝廷”。認為“革命者救世救人之聖藥也”，力主拿起武器，號召“手執鋼刀九十九，殺盡仇人方罷手”。在《猛回頭》、《警世鍾》裏，大聲疾呼“改條約，複政權，完全獨立；雪國恥，驅外族，複我冠裳”；高呼“萬眾直前，殺那洋鬼子，殺那投降洋鬼子的二毛子”，“推翻‘洋人的朝廷’清政府”，“建立民主共和國”。其遺著編為《陳天華集》。
香港舉行陳天華的追悼會，千餘人參加。次年閏四月初一，其靈柩經黃興、禹之謨倡議籌辦運回長沙，各界不顧官方阻撓，決定公葬於嶽麓山。四月初七（1907年5月29日）舉行葬儀，長沙全城各校師生紛紛參加，送葬隊伍達數萬人，綿延十餘裏，淒淒哀歌。送葬隊伍由朱張渡、小西門兩處渡河，“適值夏日，學生皆著白色製服，自長沙城中望之，全山為之縞素”。軍警站立一旁，亦為之感動，不加幹涉。後來毛澤東在《湘江評論》第4號上評價，“這是湖南驚天動地可紀的一樁事”。
陳天華有一部未能登載完畢的小說，名叫《獅子吼》，小說中通過一個夢，描繪了他心中的民主共和國：“他走到一處，看見‘共和國圖書館’的牌子，裏麵不知有幾十萬冊的書，其中‘有一巨冊金字標題《共和國年鑒》’，全國有30多萬所大小學堂、6000多萬男女學生；陸軍、海軍，軍艦、潛艇、空中戰艇等，鐵路，郵局，輪船……”這應是陳天華一直在做的，最美麗的民主之夢。
《猛回頭》最後說：“或排外，或革命，舍死做去；父而子，子而孫，永遠不忘；這目的，總有時，自然達到。”
深受陳天華事跡震動的留日學生，不光一個秋瑾，當時有一個沉默，之後棄醫從文的，是魯迅。而12年後，一位即將赴日留學的青年還不忘此事，寫下一首詩表達懷念之情，“大江歌罷掉頭東，邃密群科濟世窮。麵壁十年圖破壁，難酬蹈海亦英雄”，這個人，叫做周恩來。
舜帝姚重華的嫡裔血脈140代孫中華姚氏求正堂德府世家德主人姚丹萍〔姚舜修〕先生說∶陳天華先生以死殉國來喚醒中華民族要以人民民主政權的國度行為,是屈原之後我中華民族二千多年中第一人。