二、重組質粒pUC UCmD的構建
為缺失Bm101基因，我們構建重組質粒pUC UCmD。采用PCR擴增的方法分別得到Bm101的上遊側翼片段（U fragment）、氯黴素基因（Cm）以及下遊側翼片段（D fragment），依次將這3個片段連接到pUC18載體上。Bm101的缺失片段（KO）及其上下遊側翼片段在BmNPV基因組中的相對位置。Bm101的缺失片段長度為414bp，位於Bm101的中間，在基因組中的位置是95845~96259nt。U片段大小為806bp，位於基因組中94879~95667nt；D片段長572bp，在基因組中的位置是96259~96846nt。PCR分析後分別割膠回收酶切出來的U、Cm、D目的片段。
三、Red同源重組
同源重組敲除Bm101過程，構建的重組bacmid缺失了Bm101基因片段，相應插入了Cm基因片段，命名為pBm KO。
四、供體質粒pFPG 101Rep的構建
設計了一對引物101rescueF和101rescueR，分別以野生型BmNPV基因組DNA為模板進行PCR擴增，得到了包含其啟動子序列和polyA加尾信號區域的Bm101基因的大片段。克隆至pMD18 T載體，用Xba I和Sal I進行酶切，與同樣雙酶切的載體pFPG連接，構建得到重組質粒pFPG 101repair。
第四節 重組病毒轉染BmN細胞不同時間的熒光顯微觀察
由於所構建的pFPG質粒中gfp報告基因處於ie1啟動子下，GFP的表達在病毒感染的早期就開始，在病毒感染後12~18小時就能觀察到弱的綠色熒光（結果未顯示）。pB mWT PG和pBm KO PG 101repair轉染BmN細胞24小時用熒光顯微鏡觀察細胞，可見到散在的少量綠色熒光，熒光在視野中分布比較均勻，拯救型病毒與對照野生型病毒在細胞數量上沒有明顯差異；相比之下，pBm KO PG轉染細胞可看到的熒光則更少。轉染48小時後觀察，在pBm KO PG轉染的BmN細胞中，熒光的分布看不出明顯的變化，仍呈零星式的分布，且出現綠色熒光的細胞數與24小時相比無明顯的增加；與此相反，在pBm WT PG和pBm KO PG 101repair轉染的BmN細胞中，可觀察到成團成簇的細胞呈現綠色熒光，出現綠色熒光的細胞數與24小時相比有指數級的增加。隨著時間的延長，pBm WT PG和pBm KO PG 101repair轉染的細胞中綠色熒光越來越多，到72小時幾乎所有的細胞中都能觀察到熒光，96小時則熒光更強且所有細胞中都存在（結果未顯示），部分細胞已經變圓漂起來。直到72小時pBm KO PG轉染的BmN細胞中，熒光的分布仍看不出明顯的變化，一直呈散狀分布，發熒光的細胞數量沒有明顯變化。
第五節 重組病毒轉染BmN細胞BV增長曲線測定
利用TCID50法測定24小時、48小時、72小時、96小時、120小時收集的轉染上清液的病毒滴度，每一時間點上每一樣品設3個重複。
從轉染曲線可見，pBm KO PG在所有的時間點上其TCID50均為0，表示上清液中無感染性的病毒粒子，即pBm KO PG喪失了產生BV的能力，或者是產生的BV沒有感染性。pBm WT PG轉染後產生BV的量隨著時間的增長而增加，即初始轉染產生的BV發動了多次感染。
第六節 Bm101的亞細胞定位
為了確定Bm101的亞細胞定位，構建了供體質粒pFastbacHTb gfp Bm101和對照用的供體質粒pFastbacHTb gfp，結果在免疫熒光共聚焦顯微鏡下進行觀察。對照在轉染後24小時在整個細胞中都可以觀察到綠色熒光，一直持續到96小時。Bm101在轉染的起始階段大部分熒光聚集在細胞質中，到了轉染後36小時，仍有大部分熒光集中在細胞質內，但在細胞核中也能觀察到少量熒光。