第一節 Bm35基因生物信息學分析
一、Bm35 的序列特征
Bm35（orf35）基因位於BmNPV （T3株）基因組31903~32298nt之間，全長393bp，編碼一個含131個氨基酸殘基的蛋白，預測分子量大約為15.0 kDa。在其他杆狀病毒基因組中也發現了與其同源的基因。用EXPASY軟件對推導的氨基酸進行motif和翻譯後加工分析，結果發現在所推測的氨基酸序列中不存在信號肽序列、轉膜區、核定位區和膜滯留區，但發現一個典型的鋅指結構（78~119 aa C3HC4型）和一些重要的基序。這些基序包括：兩個酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化（Casein kinase Ⅱ phosphorylation）位點（24~27aa StvD和103~106aa）; 兩個蛋白激酶C磷酸化（Protein kinase C phosphorylation）位點（35~37aa TvR和29~61aa TdR）;一個N磷酸化（N glycosylation）位點（51~54 aa NKTL）。
二、氨基酸序列的同源性比較
對Bm35蛋白序列進行Blast搜索，結果顯示在NPV Ⅰ組杆狀病毒中發現Bm35的同源序列，這些同源序列包括: AcMNPV（orf44）、AgMNPV（orf48）、ApNPV（orf104）、CfDEFNPV（orf44）、CfMNPV（orf44）、EppoMNPV（orf41）、OpMNPV（orf49）和RoMNPV（orf42）。從這些同源序列中可以發現，Bm35同源物存在於所測序的鱗翅目NPV Ⅰ型杆狀病毒中，不存在顆粒體病毒和其他非鱗翅目昆蟲杆狀病毒中。這表明，Bm35同源蛋白可能是鱗翅目NPV特有的種、屬特異性蛋白。
Bm35蛋白的氨基酸序列與其同源序列進行多重序列比對。從比對的結果來看，Bm35蛋白的氨基酸序列與其同源序列之間的保守性很高，有36個氨基酸殘基是完全一致的，可能這36個氨基酸殘基在維持蛋白功能方麵發揮著重要作用。
同源性分析發現，Bm35與NPV Ⅰ型AcMNPV ORF44 有98%的同源性，與其他7種杆狀病毒同源性也非常高。
三、Bm35的進化分析
Bm35與AcM44和RoM42 同源關係最近。
第二節 Bm35基因在Bac to Bac家蠶杆狀病毒係統
一、重組轉移載體pFasBacHTb egfp 35的獲得
BmNPV Bm35基因長396bp。而egfp基因長720 bp，以pEGFP N1質粒為模板PCR擴增出大小約為720 bp的egfp；以BmNPV的基因組為模板，PCR擴增出大小約為400bp的Bm35。將它們分別克隆到pFasBacHTb載體上，重組載體經雙酶切和PCR鑒定，Bm35和egfp成功地克隆到pFasBacHTb載體中，最終獲得了重組轉移載體pFasBacHTb egfp 35 。該轉移載體中目的基因Bm35定向克隆到多角體強啟動子下遊，其中egfp位於Bm35的C末端。N端帶有6×His Tag，能夠進行融合表達。
二、重組家蠶杆狀病毒bacmid egfp 35的檢測
將重組轉移載體轉化到含有bacmid和輔助質粒的感受態細菌BmDH10Bac，在四環素、卡那黴素、慶大黴素、IPTG、X gal的LB瓊脂平板上獲得多個白色菌落。挑取白斑，提取重組bacmid基因組DNA，用pUC/M13引物進行PCR鑒定。發生重組bacmid的PCR產物大小應該為2430 bp加上外源插入片段的大小。電泳檢測得到大小約為3.6 kb的目的帶，而沒有發生轉座的bacmid對照PCR產物的大小約為300 bp。這與預計的大小相一致，說明外源基因Bm35和egfp已經和bacmid發生了重組，獲得的重組病毒命名為bacmid egfp 35。