一、知識目標
1.熟悉酒曲係列成分分析的原理與方法步驟。
2.了解黃水、糟醅理化指標分析的基本原理。
3.掌握黃水酸度、乙醇含量、還原糖、脂類及糟醅酸度分析的方法與步驟。
4.了解黃水中酸度、乙醇含量、還原糖、脂類分析的注意事項。
5.熟練掌握糟醅中澱粉、還原糖、乙醇的分析步驟，正確選用分析儀器。
6.了解窖泥分析中各指標測定的原理，熟練掌握窖泥中pH、銨態氮的測定方法。
7.熟悉有效磷、有效鉀及腐殖質的測定方法。
二、能力目標
1.能辨別成熟大曲質量的優劣並分析原因。
2.會正確使用分光光度計、pH計、烘箱、油浴鍋等儀器設備。
3.能應用各分析數據，指導、解決生產中的實際問題。
三、素質目標
1.具有主動參與、積極進取、團結協作、崇尚科學、探究科學的學習態度和思想意識。
2.具有理論聯係實際、嚴謹認真、實事求是的科學態度。
3.具備辯證思維能力和創新精神。
4.培養分析問題、解決實際問題的能力。
本項目主要包括酒曲分析、糖化酶製劑和活性幹酵母分析、窖泥分析、糟醅分析四個任務。
任務一酒曲分析
主要包括酒曲水分、酸度、糖化力、液化力、發酵力、蛋白酶活力、脂肪酶活力、酯化力、澱粉含量及酒曲灰分的測定等內容。酒曲是以不同原料、不同培養條件、不同曲塊形狀及不同微生物種類和數量製成的生產白酒的糖化發酵劑。在自然條件下的培養過程中，各種曲培微生物在曲培上生長繁殖，分泌出的酶類使曲子具有液化力、糖化力、蛋白質分解力和發酵力等，並形成各種代謝物，對白酒風味、質量起重要作用。酒曲的分析項目分為感官檢查和化學分析，感官檢查包括色澤、氣味、鬆緊程度、菌絲生長情況及是否染雜菌，化學分析包括水分、酸度、糖化力、澱粉、灰分等，不同製曲條件下成品曲外觀質量與化學成分會產生差異。本項目主要介紹化學分析的內容。取具有代表性的曲塊至少5塊，用榔頭從中間橫向砸斷，將半塊分為4小塊，取其對角的兩塊砸碎，按四分法縮分試樣至500g左右，用粉碎機粉成細粉，裝入磨口瓶中待測。
任務二糖化酶製劑和活性幹酵母分析
主要包括窖泥中水分及揮發物的測定、pH、氨態氮、有效磷、有效鉀、有機質測定等內容。窖泥是濃香型大曲酒生產過程中的重要條件之一，它對酒中微量香味成分的形成具有重要作用。窖泥質量的好壞直接影響濃香型大曲酒產品質量的好壞，因此分析窖泥有效成分很重要。取回的窖泥因水分大，不宜長時間貯存於容器中，應立即平攤在磁盤、木板或光潔地麵，層厚約2cm，風幹3~5晝夜，間隔翻拌（不定時地進行翻窖泥工作），使之均勻風幹。在半幹時，將大塊搗碎。泥樣風幹後，用四分法分取250g，研磨成粉，並通過60目篩，保存在磨口瓶中。
任務三窖泥分析
主要包括糟醅水分及揮發物、酸度、還原糖、澱粉含量及酒精含量的測定等內容。酒醅分析包括入池和出池醅中水分、酸度、還原糖、總糖及出池醅和酒糟中酒精含量的測定等。酒醅中各成分分布不均，取樣應力求具有代表性。入池醅從堆的四個對角部位及中間的上、中、下層取樣。出池酒醅在窖池內按酒曲出房的取樣方法，在窖壁、窖中的上、中、下層等量取樣。用四分法縮合後，取供試樣品250g。
任務四糟醅分析
主要包括黃水的pH、酸度、酒精含量、總酯、還原糖及單寧的測定等內容。黃水來源有兩條途徑：一條是在白酒生產中，隨著發酵的進行，微生物代謝生成的水；另外一條是含水量為52%～55%的入窖酒醅，經厭氧發酵後未被微生物所利用的水分。水分逐漸沉降時將酒醅中的酸、酯、還原糖、酵母溶出物、可溶性澱粉、單寧及香味前體物質等溶於其中並沉積於窖池底部，形成棕黃色黏稠狀液體。
任務一酒曲分析
一、學習目的
1.掌握酒曲係列成分測定的基本原理與分析方法。
2.掌握鄰苯二甲酸氫鉀及氫氧化鈉溶液的配製及滴定等基本操作技能。
3.熟悉糖化力分析、脂肪酶活力測定、曲粉灰分測定原理。
4.熟練運用高溫爐、幹燥器、分光光度計、酸度計等設備。
二、知識要點
1.溶液的配製。
2.酒曲的分析過程、技巧及測定方法。
3.高溫爐、幹燥器、分光光度計、酸度計等設備的熟練運用。
4.實驗中的數據處理與計算。
三、相關知識根據製曲過程中曲塊最高品溫的不同，一般把大曲分為高溫曲和中溫曲。高溫曲的最高製曲品溫達60℃以上，主要用於生產茅香型（醬香型大曲酒）和瀘香型（濃香型）大曲酒。中溫曲的最高製曲品溫一般不超過50℃，它主要用來生產汾香型（清香型）大曲酒，某些瀘香型曲酒為了提高曲和酒的香味，從20世紀60年代中期開始逐漸將製曲溫度升高為55～60℃，成為偏高溫曲。為了提高酒的香氣，除汾酒大曲和董酒麥曲外，絕大多數名、優酒廠都傾向於高溫製曲。
四、任務實施
（一）酒曲水分的分析水分在製曲過程中與菌的生長和酶的生成密切相關，成品曲尤為重要，一般含量為12%～13%，嚴格控製成品曲的水分含量，有利於保證曲子在白酒生產過程中的最優作用效果。
1.儀器恒溫烘箱、分析天平（0.1mg）、稱量瓶、幹燥箱、藥匙。
2.訓練內容通過此項訓練，熟悉酒曲水分測定的原理，掌握烘箱使用、稱量瓶洗滌、稱重的基本操作技能。
（1）測定過程
①取稱量瓶洗淨、烘幹、冷卻，準確稱重（m0）。
②於已稱重的稱量瓶中放入約5g酒曲試樣，準確稱重（m1）。
③將電烘箱調節至105℃，恒溫後放入試樣烘3h。
④取出，幹燥器中冷卻30min，準確稱重（m2），直至恒重。
⑤平行4次。
（2）結果計算和報告水分及揮發物含量（%）=（m1-m2）/（m1-m0）×100式中m0——稱量瓶質量，gm1——烘前試樣與稱量瓶質量，gm2——烘後試樣與稱量瓶質量，g結果保留到小數點後一位，平行實驗結果允許差0.2%。
（3）注意事項本實驗操作與計算簡單，但仍須注意以下細節：
①稱重前幹燥冷卻至常溫，一般冷卻30min。
②試樣約5g，過多會使得幹燥時間延長，過少可能會導致誤差較大。
（二）酸度分析利用酸堿中和反應，以中和法測定，即RCOOH+NaOHRCOONa+H2O酸度的定義：100g曲消耗1mmolNaOH為1個酸度。
1.藥品與儀器
（1）主要藥品鄰苯二甲酸氫鉀、氫氧化鈉、酚酞指示劑。
（2）主要儀器分析天平、250mL燒杯、250mL錐形瓶、100mL量筒、10mL吸管、50mL堿式滴定管、50mL量筒、漏鬥、電烘箱、1000mL容量瓶、1000mL量筒。
2.訓練內容通過此項訓練，熟悉酸度測定原理、氫氧化鈉標準溶液配製的原理，掌握酒曲樣品的預處理、鄰苯二甲酸氫鉀及氫氧化鈉溶液的配製及滴定等基本操作技能。
（1）0.1mol/L的NaOH溶液及1%酚酞指示劑的配製
①0.1mol/L的NaOH溶液：標定：準確稱取鄰苯二甲酸氫鉀（預先於105℃烘2h）0.5～0.6g（精確至0.0001g）於250mL錐形瓶中，各加50mL煮沸後剛剛冷卻的水使之溶解，再滴加2滴酚酞指示劑，用NaOH溶液滴定至微紅色（30s不消失）。要求三份標定的相對平均偏差應小於0.2%。c（NaOH）=m204.2×V×1000式中c（NaOH）——NaOH標準溶液的濃度，mol/Lm——鄰苯二甲酸氫鉀的質量，g204.2——鄰苯二甲酸氫鉀的摩爾質量，g/molV——滴定時消耗NaOH標準溶液的體積，mL；
②1%酚酞指示劑：稱取酚酞1g，溶於100mL75%乙醇中。
（2）酒曲酸度分析
①試樣處理：根據試樣的水分，稱取以10g絕幹曲計的曲粉量，置於250mL燒杯中，加100mL蒸餾水攪勻，在室溫下浸泡30min，經常攪拌、脫脂棉過濾備用。
②滴定：取濾液20mL，加水20mL，加2滴指示劑，用0.1mol/L氫氧化鈉標準溶液滴定，酚酞指示劑由無色變為微紅10s不褪色時停止，記錄消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，平行4次。
③結果計算和報告酸度=cV10×20100×100式中c——氫氧化鈉標準溶液的實際濃度，mol/LV——滴定消耗氫氧化鈉標準溶液的體積，mL10×20100——樣品質量，g結果保留到小數點後一位，平行實驗結果允許差0.2%。
（三）糖化酶活力測定固態曲中糖化酶（包括α-澱粉酶和β-澱粉酶）能將澱粉水解為葡萄糖，進而被微生物發酵，生成酒精。糖化酶活力高，澱粉利用率就高。糖化力的定義是1g幹曲在40℃、pH4.6條件下，1h分解可溶性澱粉生成1mg葡萄糖，為1個酶活力單位，以U/g表示。測定低濃度時，可采用降低斐林液濃度的標準糖液反滴定法。為使終點易於判斷，加入亞鐵氰化鉀，溶解氧化亞銅紅色沉澱生成淺黃色溶液。
1.藥品與儀器
（1）主要藥品硫酸銅、次甲基藍、酒石酸鉀鈉、氫氧化鈉、亞鐵氰化鉀、葡萄糖、無水醋酸鈉、冰醋酸、可溶性澱粉、氫氧化鈉、醋酸鈉、硫酸。
（2）主要儀器分析天平、電烘箱、電爐、水浴鍋、堿式滴定管、容量瓶。
2.訓練內容通過此項訓練，熟悉酒曲糖化能力測定的原理，掌握相關溶液配製及糖化能力測定的操作技能。
（1）試劑溶液的配製
①2%可溶性澱粉溶液
②0.1%標準葡萄糖液：準確稱取預先在100～105℃烘幹的無水葡萄糖1.0g（用減量法快速稱量，精確到0.0001g），溶解於水，加5mL濃鹽酸，用水定容到1L。
③斐林試劑：甲液：稱取15g（CuSO4·5H2O）、0.05g次甲基藍，溶解於水，稀釋至1L。乙液：稱取50g酒石酸鉀鈉、54g氫氧化鈉、4g亞鐵氰化鉀，溶於水，稀釋至1L。
④醋酸、醋酸鈉緩衝液（pH4.6）
⑤0.5mol/L硫酸溶液：量取28.3mL濃硫酸，小心地緩慢倒入水中，稀釋至1L。
⑥1mol/L氫氧化鈉溶液：稱取40g氫氧化鈉，溶於水，稀釋至1L。
（2）酒曲糖化力分析
①5%曲子浸出液製備：稱取相當於5g幹曲的曲粉，放在250mL燒杯中，加水（90.5×水分%）mL，緩衝液10mL，在30℃水浴中浸出1h，每隔15min攪拌一次。然後用幹濾紙過濾，棄去最初5mL，接收50mL澄清濾液備用。
②糖化力測試液製備：曲子浸出液的糖化試液：準確吸取2%可溶性澱粉50mL於100mL容量瓶中，在35℃水浴中保溫20min後，準確加入酶浸出液10mL，搖勻並開始計時，在35℃水浴中準確保溫1h，立即加入3mL1mol/L的氫氧化鈉，振蕩，以停止反應。再冷卻到室溫，用蒸餾水定容至刻度。空白試液：準確吸取2%可溶性澱粉溶液50mL於100mL容量瓶中。先加1mol/L氫氧化鈉3mL，混合均勻後再加酶浸出液10mL，用蒸餾水定容，搖勻。
③糖分測定：糖化液測定：準確吸取5mL糖化試液於盛有斐林甲、乙液各5mL的150mL錐形瓶中，加入適量0.1%標準葡萄糖溶液（使最後滴定消耗標準糖液在0.5～1.0mL），搖勻，在電爐上加熱至沸後，立即用標準糖液滴定至藍色消失。此滴定應在1min內完成，滴定消耗標準糖液體積V。空白液測定：以5mL空白液代替糖化試液，其他操作同上，消耗體積V。
④計算X=（V0-V）ρ5×10100×5100×1000式中V0——5mL空白液消耗0.1%標準糖液的體積，mLV——5mL糖化液消耗0.1%標準糖液的體積，mLρ——標準葡萄糖液濃度，g/mL5×10100——5g幹曲浸出後再於100mL中取10mL進行糖化實驗5100——在100mL糖化液中取5mL定糖1000——換算成mgX——糖化酶活力，U/g；
（3）注意事項
①曲子浸出時間應嚴格控製。
②糖化溫度應嚴格控製。
③滴定終點的顏色判斷。
（四）液化型澱粉酶活力測定液化型澱粉酶俗稱α-澱粉酶，又稱α-1,4糊精酶，能將澱粉中的α-1,4葡萄糖苷鍵隨機切斷成分子鏈長短不一的糊精、少量麥芽糖和葡萄糖而迅速液化，並失去與碘變成藍紫色的作用，呈紅棕色。藍紫色消失的快慢是衡量液化酶大小的依據。液化酶活力定義為：1g固體在60℃、pH6條件下，1h液化1g可溶性澱粉，稱為1個酶活力單位，以U/g表示。通過此項訓練，熟悉酒曲液化能力測定的原理，掌握相關溶液配製及糖化能力測定的操作技能。
1.藥品與儀器
（1）主要藥品碘、碘化鉀、可溶性澱粉液、磷酸氫二鈉、檸檬酸。
（2）主要儀器水浴鍋、電爐、試管、白磁板。
2.訓練內容
（1）試劑溶液配製
①原碘液：稱取11g碘、22g碘化鉀，置於研缽中，加少量水研磨至碘完全溶解，用水稀釋至500mL，貯於棕色瓶。
②稀碘液：吸取2mL上述碘液，加20g碘化鉀，用水稀釋至500mL。
③2%可溶性澱粉溶液：用分析天平準確稱取幹燥除去水分的可溶性澱粉2g（精確到0.001g），置於50mL燒杯中用少量水調勻後，倒入盛有70mL沸水的150mL燒杯中，並用20mL水分次洗淨，洗液合並其中，用微火煮沸到透明，冷卻後用水定容到100mL，當天配製當天應用。
④磷酸氫二鈉-檸檬酸緩衝液（pH6.0）：稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）45.23g，檸檬酸（C6H8O7·12H2O）8.07g，溶解於水，稀釋至1L。
（2）液化型澱粉酶活力測定
①5%酶液製備：稱取相當於10.0g的絕幹曲粉樣品（曲粉=10×100100－水分%g）於500mL燒杯中，加入預熱到40℃的緩衝液200mL［對於絕幹曲而言，若曲子含水，加入緩衝液的體積應為（200－10×水分%）mL］。於40℃水浴鍋中浸1h（每15min攪拌1次）。然後用定性濾紙過濾，棄去最初的5～10mL，濾液即為供試酶液。
②測定：在25mm×200mm帶蓋試管中，用移液管注入20mL2%可溶性澱粉溶液和5mLpH6的緩衝液，置於60℃水浴中預熱10min。準確加入1mL酶浸出液，立即計時，充分搖勻。定時取出約0.5mL反應液，滴入預先盛有稀碘液（約1.5mL）的白磁板孔中，呈色反應由藍紫色逐漸變為紅棕色，記下反應時間，以第一次無藍色為終點。要求酶解反應在2～3min內完成，否則調整酶濃度重新測定。所用酶液總體積以V表示，反應時間為t（min）。
③結果計算液化型澱粉酶活力（U/g）=20×2%×6010×1V×t式中10×1V——固體曲用量（10g曲粉定容到VmL中取1mL）20×2%——反應液中澱粉的質量，gt——酶反應時間，min60——1h；
（3）注意事項
①過濾時用定性快速濾紙為好。
②嚴格控製反應溫度及時間，澱粉規格、牌號應一致。
（五）蛋白酶活力的測定微生物的生育及酶的生成都需要蛋白質作氮源，白酒中許多香味物質也來自於蛋白質的分解產物。所以在白酒釀造過程中不能忽視蛋白質及蛋白酶的分解能力。蛋白酶是水解蛋白質肽鍵的酶類的總稱。它能將蛋白質水解為氨基酸，通常以適宜於酶活力的pH將蛋白酶分為酸性蛋白酶（pH2.5～3）、中性蛋白酶（pH7左右）和堿性蛋白酶（pH8以上）。其酶活力測定方法基本相同，僅控製不同的pH進行測定即可。在測定蛋白酶活力時，以酪蛋白（幹酪素）為底物，蛋白酶將酪蛋白水解，生成含酚基的酪氨基，在堿性條件下使福林試劑還原產生藍色（鉬藍和鎢藍的混合物），用分光光度計在680nm處測定吸光度。蛋白酶活力的定義是1.0g固體幹曲在40℃和一定的pH條件下，1min將酪蛋白水解產生1μg氨基酸，為1個酶活力單位，以U/g或（U/mL）表示。
1.藥品與儀器
（1）主要藥品鎢酸鈉、溴、磷酸、濃鹽酸、硫酸鋰、鉬酸鈉、碳酸鈉、三氯醋酸、幹酪素、磷酸二氫鈉、硼砂、氫氧化鈉、L-酪氨酸、乳酸、乳酸鈉、磷酸氫二鈉。
（2）主要儀器回流冷凝器、通風櫥、冰箱、恒溫水浴鍋、離心機。
2.訓練內容通過此項訓練，熟悉蛋白酶作用的原理，掌握各種溶液的配製、保存及蛋白酶活力測定的基本技能操作。
（1）溶液的配製
①福林試劑：稱取50g鎢酸鈉（Na2WO4·2H2O）、12.5g鉬酸鈉（Na2MoO4·2H2O）於1000mL燒杯中，加入350mL水、25mL85%的磷酸、50mL濃鹽酸，微沸，回流10h。取下回流冷凝器後，加入25g硫酸鋰（Li2SO4）、25mL水，混勻，加入數滴溴（99.9%）脫色，直至溶液呈金黃色。再微沸15min，驅除殘餘的溴（在通風櫥中操作）。冷卻後用4號耐酸玻璃濾器抽濾，濾液用水稀釋至500mL。使用時再用水稀釋，濾液∶水=1∶2。
②0.4mol/L碳酸鈉溶液：稱取42.4g碳酸鈉，溶於水並稀釋至1L。
③0.4mol/L三氯醋酸溶液（CCl3COOH）：稱取65.5g三氯醋酸溶於水，並稀釋至1L。
④10g/L酪蛋白溶液取1g酪蛋白（即幹酪素，精確到0.001g），於100mL容量瓶中，加入約40mL水及2～3滴濃氨水，於沸水浴中加熱溶解。冷卻後用pH7.5的磷酸緩衝液（用於測定中性蛋白酶）稀釋定容至100mL，貯存於冰箱中備用，有效期為3d。
⑤磷酸緩衝液（pH7.5）：0.2mol/L磷酸二氫鈉溶液：稱取31.2g磷酸二氫鈉（NaH2PO4·2H2O）溶於水並稀釋至1L。0.2mol/L磷酸氫二鈉：稱取71.6g磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）溶於水並稀釋至1L。取28mL磷酸二氫鈉溶液和72mL磷酸氫二鈉溶液，用水稀釋至1L，即為pH7.5磷酸緩衝液。
⑥標準L-酪氨酸溶液（100μg/mL）：準確稱取105℃幹燥過的L-酪氨酸0.1000g於100mL容量瓶中，加60mL1mol/L鹽酸溶液，在水浴中加熱溶解，用水定容至刻度，其濃度為1mg/mL。再用0.1mol/L鹽酸稀釋10倍，即為100μg/mL標準溶液。
⑦乳酸-乳酸鈉緩衝液（pH3.0）：稱取80%～90%的乳酸10.6g，用水定容至1L；稱取純度為70%的乳酸鈉16g，用水溶解，定容至1L；吸取上述乳酸液8mL和乳酸鈉液1mL，混勻並稀釋1倍，即為0.05mol/L乳酸-乳酸鈉緩衝液。
⑧硼砂-氫氧化鈉緩衝液（pH10.5）：0.1mol/L氫氧化鈉溶液；0.2mol/L硼砂溶液——稱取19.08g硼砂，溶於水並稀釋至1L；取400mL氫氧化鈉溶液和500mL硼砂液混合，並用水定容至1L，即為pH10.5的硼砂-氫氧化鈉緩衝液。
（2）蛋白酶活力的測定
①標準曲線的繪製：準備9支20mL帶蓋試管，用100μg/mL的標準酪氨酸溶液配製標準係列。標準酪氨酸溶液的配製試管編號標準酪氨酸/mL加水量/mL稀釋液濃度/mL0#01001#19102#28203#37304#46405#55506#64607#73708#8280吸取稀釋後的標準溶液各1.00mL，分別放在9支10mL試管中，加入5.00mL0.4mol/L碳酸鈉和1.00mL福林試劑，在（40±0.2）℃水浴中加熱20min顯色，在680nm波長處測光密度，以不含酪氨酸的“0”試管為空白。繪製濃度對光密度通過零點的校正曲線。在曲線上查得光密度為1時對應酪氨酸的μg數，即為吸光值常數K值。該K值應在95～100範圍內，可作為常數用於試樣計算。但若更換儀器或新配顯示劑，則應重測K值。
②5%酶浸出液（中性酶）：稱取相當於10g幹曲的試樣（精確到0.01g）［10×100/（100-水分%）］，加pH7.2磷酸緩衝液（使體積為200mL），在40℃水浴中浸出30min，根據酶活力高低，必要時可用緩衝液稀釋一定倍數，以使光密度的測定值在0.2～0.4。用幹的定性濾紙（棄去最初幾毫升），即為酶浸出液。
③試樣測定：準確吸取酶浸出液1mL，注入10mL離心管中（一式三份），在（40±0.2）℃水浴中預熱5min，準確加入2%酪蛋白溶液1mL，保溫10min，立刻加入2mL0.4mol/L三氯醋酸，以沉澱多餘的蛋白質，中止反應。15min後離心分離（或用幹濾紙過濾）。準確吸取上層清液1.00mL，注入試管中，加入5.0mL0.4mol/L碳酸鈉溶液和1.00mL福林試劑，搖勻，在（40±0.2）℃水浴中加熱20min顯色。
④空白實驗：與試樣測定同時進行，離心管中先後注入酶浸出液1mL、三氯醋酸2mL、2%酪蛋白1mL。15min後離心分離或過濾，以下的操作均與試樣測定相同。
⑤比色測定光密度：以空白試液為對照，在680nm波長下測試樣的光密度，取3次平均值。
⑥計算蛋白酶活力（U/g）=K×Em×(1/200)×(1/4)×10式中K——光密度為1時相當的酪氨酸微克數E——試樣平均光密度m——相當於10g幹曲的試樣質量，g。
（1/200）×（1/4）——試樣稀釋倍數10——反應時間，min；
（六）發酵力測定酒曲是糖化發酵劑。其中的酵母能使酒醅中的還原糖發酵，生產酒精和二氧化碳，反應式為：C6H12O62C2H5OH+2CO2↑所以可使用在一定條件下製備的糖化液作為培養基，測定發酵過程中生成的CO2量，以衡量酒曲的發酵力。
1.藥品與儀器
（1）主要藥品硫酸、碘液。
（2）主要儀器發酵瓶（帶發酵栓）、250mL容量瓶、保溫箱、滅菌鍋、分析天平。
2.訓練內容通過此項訓練，熟悉發酵力測定的原理，掌握所需溶液的配製，糖化液製備、滅菌及曲粉的發酵培養等基本實踐操作技巧。
（1）溶液的配製
①硫酸溶液［5mol/L（1/2H2SO4）］：取14mL濃硫酸，邊攪拌邊緩慢加入50mL水中，用水稀釋至100mL，不必標定。
②碘液［0.1mol/L（1/2I2）］：不用標定。
（2）曲粉發酵力的測定
①糖化液製備：取大米、玉米麵或薯幹澱粉原料50g，加水250mL，混勻，蒸煮1～2h，使成糊狀。冷卻到60℃，加入原料量15%的大曲或小曲粉，再加50mL預熱到60℃的水，攪勻。在60℃糖化3～4h，至取出一滴與碘不顯藍色為止，加熱到90℃，用白布過濾，濾液備用。
②滅菌：取150mL糖化液於250mL發酵瓶中，塞上棉塞並包上油紙，記錄液麵高度。同時用油紙包好發酵栓，一起放入滅菌鍋中，在98kPa壓力下滅菌15min。
③發酵、測定：滅菌後的糖液冷卻到25℃左右時，在無菌條件下加入曲粉1.00g，發酵栓加入10mL5mol/LH2SO4（1/2H2SO4）。用石蠟密封發酵瓶，擦幹瓶外壁，在千分之一感量的天平上稱量。然後，放入25℃保溫箱中發酵48h。取出發酵瓶，輕輕搖動，使二氧化碳全部逸出，在同一天平上再稱重。發酵力（以CO2的質量分數計，g/100g)=m1－m2m×100式中m1——發酵前發酵瓶加內容物質量，gm2——發酵後發酵瓶加內容物質量，gm——取樣質量，g；
（七）脂肪酶活力測定脂肪酶在一定條件下，能使甘油三酯水解成脂肪酸、甘油二酯、甘油單酯和甘油。所產生的脂肪酸可用堿酸中和法測定，根據消耗堿量計算酶活力。1g固體曲粉於40℃、pH7.5條件下水解脂肪，1min產生1μmol的脂肪酸，為1個脂肪酶單位，以U/g表示。
1.藥品與儀器
（1）主要藥品聚乙烯醇、橄欖油、酚酞、磷酸二氫鉀、磷酸氫二鈉、氫氧化鈉、乙醇。
（2）主要儀器水浴鍋、搗碎機、冰箱、天平、pH計。
2.訓練內容通過此項訓練，熟悉脂肪酶活力測定的原理，掌握所需溶液的配製、酶浸出液製備、試樣測定等基本實踐操作技巧。
（1）溶液的配製
①聚乙烯醇（PVA）聚合度（1750±50）底物溶液製備：稱取PVA40g放入1L燒杯，加水800mL，在沸水浴中加熱，不時攪拌直至全部溶解，冷卻後定容到1L，用雙層紗布過濾後備用。吸取上述濾液150mL，加橄欖油50mL。用高速組織搗碎機處理2次，每次3min，中間間隔5min，即成乳白色的底物乳化液。貯於冰箱中可供1周使用。
②橄欖油。
③體積分數為95%的乙醇。
④0.025mol/L磷酸緩衝液（pH7.5）：稱取磷酸二氫鉀（KH2PO4）17.01g溶於水，稀釋至500mL，再稱取磷酸氫二鈉（Na2HPO4·12H2O）44.7g溶於水中，稀釋至500mL；取13mL磷酸二氫鉀溶液和100mL磷酸氫二鈉溶液混合均勻。使用時用水稀釋10倍，即為0.025mol/L緩衝液，用pH計測定並校正。
⑤0.05mol/l氫氧化鈉溶液。
⑥10g/L酚酞指示劑。
（2）脂肪酶活力測定
①5%酶浸出液製備：稱取相當於10g幹曲的試樣（精確至0.01g）［曲粉量=10×100/（100－水分%）g］，加入pH7.5緩衝液，使體積為200mL，在（40±0.2）℃水浴中浸泡30min，並不時攪拌。應根據酶活力高低確定稀釋倍數，要求樣品與空白滴定消耗堿液體積之差在1～2mL。浸泡後用定性濾紙過濾，濾液備用。
②試樣測定:取兩個100mL錐形瓶，各加底物乳化液4mL和磷酸緩衝液5mL。在空白瓶（瓶A）中先加入95%乙醇15mL。將兩瓶置於（40±0.2）℃水浴中預熱5min。各加試樣濾液1.00mL，立刻混勻，在（40±0.2）℃水浴中準確反應15min。在試樣瓶（瓶B）中補加95%乙醇15mL以中止反應，取出錐形瓶，冷卻至室溫。
③酸堿滴定：於A、B兩瓶中各加酚酞指示劑2滴，用0.05mol/LNaOH滴定至微紅色，以10s不褪色為終點，記錄消耗NaOH的體積。
④計算X=(V-V1)×c0.05×50m×1200×10×15式中X——樣品酶活力，U/gV——樣品瓶滴定消耗NaOH的體積，mLV1——空白瓶滴定消耗NaOH的體積，mLc——氫氧化鈉標準溶液濃度，mol/L0.05——換算到0.05mol/L標準濃度的係數50——每1mL0.05mol/LNaOH相當於脂肪酸50μmol1200——稀釋倍數，試樣溶在200mL溶液中取1mL用（若酯化酶活力小，溶在100mL中取1mL用，則稀釋倍數應改為1100）m——試樣質量，g。
（八）酯化力及酯分解率測定酯化酶是脂肪酶和酯酶的總稱，它與短碳鏈香酯的生物合成有關。白酒香味是以酯香為主的複合體，白酒釀造過程中酯酶的作用是使一個酸元和一個醇元結合，脫水而生成酯，反應式如下：RCOOH+C2H5OHRCOOC2H5+H2O但酯化過程是一可逆反應，酯酶既能產酯，也能使酯分解殆盡，例如，
CH3COOC2H5+O22CH3COOH
CH3COOH+2O22H2O+2CO2特別是在不適宜的酯化條件下（如溫度、pH、空氣量等），會將已生成的酯迅速分解，因而不僅要選育產酯能力強的菌，而且要考慮其酯分解能力相對較弱，才能使最終產物中留存較多的酯類。目前已確認能生成酯化酶的酯化菌在細菌、黴菌、酵母菌中均存在，隻是其酯化能力和酯分解率不同，在一定程度上影響其酯生成量的多少，所以對大曲而言，酯化能力和酯分解能力的測定同樣重要，以己酸乙酯計，酯化力是1g幹曲在30～32℃反應100h所產生的己酸乙酯的質量（mg）。
1.藥品與儀器
（1）主要藥品NaOH、H2SO4、己酸、乙醇、醋酸、醋酸鈉、己酸乙酯。
（2）主要儀器恒溫水浴鍋、蒸餾燒瓶、恒溫培養箱、冷凝回流裝置。
2.訓練內容通過此項訓練，熟悉酯酶活力測定的原理，掌握溶液的配製、酯化液製備及測定等操作技巧。
（1）溶液的配製
①0.1mol/LNaOH。
②0.05mol/LH2SO4。
③1%己酸溶液［20%（體積分數）乙醇溶液配製］：準確吸取1mL己酸（AR級）於100mL容量瓶中，用20%乙醇稀釋至刻度。
④醋酸-醋酸鈉緩衝液（pH4.6）：同純澱粉測定所用的緩衝液。
⑤100mg/100mL己酸乙酯的20%（體積分數）乙醇溶液。
（2）酯化力測定
①酯化液製備：取100mL1%己酸乙醇溶液於250mL蒸餾燒瓶中，加入相當於5g幹曲的曲粉［曲粉量=5×100/（100－水分%）g］，在30～32℃保溫酯化100h，然後加水50mL，加熱蒸餾，接收蒸出液100mL，用化學分析法測定餾出液中的己酸乙酯含量（同白酒總酯測定）。
②酯含量測定：吸取50mL蒸餾液，用0.1mol/LNaOH中和至酚酞終點，準確加入0.1mol/LNaOH25mL，沸水浴中回流皂化30min（或室溫暗處放置24h），冷卻後用0.05mol/LH2SO4滴定至酚酞粉色消失為終點。
③計算酯化力（mg/g）=c1V1-c2V250100×m×144式中c1，c2——分別為NaOH和H2SO4溶液的濃度，mol/LV1，V2——分別為NaOH和H2SO4標準溶液的體積，mLm——幹曲質量，g50/100——從蒸出液100mL中取50mL測酯144——己酸乙酯的換算係數
④用氣相色譜分析己酸乙酯含量：吸取5mL餾出液，加0.1mL2%內標物，進樣0.5～1μL。酯化力（mg/g）=fAimsAs×m×5100×1000式中f——己酸乙酯的定量校正因子Ai——己酸乙酯的峰麵積，cm2As——內標物的峰麵積，cm2ms——內標量（0.1×2%），mgm——相當於5g幹曲的曲粉量，g5/100——試樣稀釋倍數1000——換算到mg。
（3）酯分解率測定
①酯解：吸取100mL己酸乙酯溶液於500mL錐形瓶中，加入相當於5g幹曲的曲粉和10mLpH4.6緩衝液。加蓋，在30～32℃保溫反應100h，加水40mL，蒸出100mL，酯含量的測定同酯化力測定法。同時做空白實驗，在100mL己酸乙酯中加同量曲粉和緩衝液後立即加水40mL。蒸出100mL，測酯含量。
②測酯：試樣蒸出液和空白液各吸取50mL，分別注入250mL錐形瓶中，測定方法同酯化力的酯含量測定。
③計算試樣酯含量（mg/g）=c1V1-c2V250100×m×144空白酯含量（mg/g）=c1V1-c2V050100×m×144式中c1，c2——分別為NaOH和H2SO4標準溶液的濃度，mol/LV1——加入NaOH標準溶液的體積，mLV2——滴定試樣消耗H2SO4標準溶液的體積，mLV0——滴定空白樣消耗H2SO4標準溶液的體積，mLm——相當於5g幹曲的曲粉質量，g50/100——試樣分取倍數，即從蒸出液100mL中取50mL測酯144——換算係數酯分解率（%）=試樣酯含量空白樣酯含量×100
（九）澱粉的分析酒曲中澱粉的分析方法參照原料中粗澱粉的分析。