正德十六年（1521）四月二十二日，世宗到達北京城外，進城的禮儀就成為第一個問題。禮部員外郎楊應奎、郎中俞才照皇太子即位之禮擬定儀注，即由東安門入，宿文華殿。世宗看過後，對身邊的興獻王府長史袁宗皋說：“遺詔是讓我來做皇帝的,不是皇子。”楊廷和請求按既定的皇太子禮儀行事，然而世宗以遺詔為依據，不同意如此行事。最後，太後不得不命楊廷和等人先實施“勸進”的程序，這就是先在形式上確認世宗為皇帝，然後再按皇帝的儀式讓世宗入京，朝見太後、武宗皇後，禦奉天殿，即皇帝位。
在第一個回合的較量上，世宗小勝。但是，接下來的“大禮儀”，卻牽動著整個嘉靖初年的政局。
過了三天，世宗派遣官員議定祭祀生父興獻王的儀式。楊廷和從典籍中查出了漢朝定陶王、宋朝仆王的事例交給尚書毛澄，道：“應以此為據，尊奉孝宗為皇父，稱呼興獻王為皇叔父興獻王，母妃為皇叔母興獻太妃，自稱為侄皇帝署名，另外立益王第二子崇仁王為興獻王，供奉興獻王祭禮。有不同意見者都乃奸佞小人，理應斬首。”但進士張璁對侍郎王瓚說，皇帝入繼帝統，不是做別人的後代，應尊生父為皇父。楊廷和怕他幹擾議事，立即改調王瓚至南京任官去了。
同年五月，禮部尚書毛澄彙集朝廷大臣的意見上報，都與楊廷和說的一樣，世宗很不高興，他每次召見楊廷和，都從容賜茶慰諭，想要讓他改訂，楊廷和卻仍舊不肯順從世宗的意圖。於是世宗命令朝廷群臣再議。楊廷和與蔣冕、毛紀一同上奏說：“過去朝代入繼的君主，追尊生身父母，都不合乎典禮。隻是宋朝大儒程頤的《濮議》是最正確的義理，可以被萬代效法。至於興獻王的祭祀，雖然由崇仁王主持，以後陛下的子孫逐漸增多，仍然讓第二子作為興獻王的後代繼承人，而改封崇仁王為親王，那麼天理和人情，就可以兩全其美，沒有缺失了。”
世宗更加不快，命令廣泛查考典籍儀禮，一定要搜求到最恰當的辦法。楊廷和、蔣冕、毛紀又道：“三代以前，沒有誰比舜更賢明的，沒有聽說他追尊生父瞽叟。三代以後賢能沒有比得過漢光武帝的，也沒有聽說他追尊生父南頓君。隻要皇帝效法這兩位君王，那麼道德上沒有瑕疵，盡心父母的孝道也能發揚光大了。”毛澄等人也接連堅持上奏。世宗卻把奏疏留下不發。
七月，張璁上奏說，應當尊世宗生父為皇帝，按皇帝的儀禮祭祀興獻王。世宗連忙派遣司禮太監拿著奏疏給楊廷和看，並說這一主張遵循祖訓，依據古禮，宜予聽從。楊廷和看罷，道：“秀才哪裏懂得國家大事？”仍不從。
不久，世宗在文華殿召見楊廷和、蔣冕、毛紀，交給他們自己親筆所寫的敕書，令尊奉他的生身父母為皇帝、皇後。楊廷和仍舊不同意，並封還了世宗的親筆詔書。群臣都堅持以前的看法。世宗也仍舊堅持不予接受。此事就又擱置了。
九月，世宗生母興獻王妃到達京師，世宗自己製禮儀使其從中門進入皇宮，拜謁太廟，又一次申明要加稱興獻王、興獻王妃為皇帝、皇後。楊廷和道：“漢宣帝繼承孝昭皇帝以後，他的生身父母死後根據生平事跡給的稱號是‘悼考’、‘悼後’；光武帝繼承元帝，給父祖在章陵建立宗廟，都不曾追尊。今日如果加上‘皇’字，和先皇先後孝宗、慈壽並列，是忘記了自己所繼承者而偏重生身者。重個人私恩而丟棄國家大義，臣等不能承擔此責任。”並請求罷官離職。朝廷大臣一同直言規勸的有一百多人。最終，世宗隻得稱孝宗為皇父，慈壽皇太後為聖母，興獻王、妃稱本生父母，沒有稱之為皇帝、皇後。
楊廷和先後封還世宗的禦批四次，堅持上奏將近三十次。世宗每每想起多有記恨。左右的人因此乘機說楊廷和放肆，缺少做臣下的恭順之意。科道官曹嘉看到這是一個討好世宗的機會，於是建議彈劾楊廷和。世宗雖為此輕責曹嘉，以讓楊廷和安心，然而內心的主意已定，那就是一定要驅逐楊廷和。不久，世宗論策冊的功勞，封楊廷和、蔣冕、毛紀為伯爵，每年賜俸祿1000石，楊廷和堅持推辭。後改為任用一子為錦衣衛指揮使，楊廷和又推辭。皇帝以為賞賜太輕，增蔭一個四品京官世襲，楊廷和再次推辭。此時正好到了四次考滿之期，世宗又越級拜楊廷和為太傅。這次，楊廷和又推辭了四次才作罷。
後來世宗要舉行大量的齋醮祭禮活動，楊廷和援引梁武帝、宋徽宗的事為例，極力勸說，但世宗這次並不接受，他派人督促織造，還催促內閣撰寫敕書。楊廷和等人拒不遵行命令，並極力陳述百姓困苦、財用竭盡。世宗之意甚決。
楊廷和極力爭執道：“臣等和滿朝文武大臣、言官的話不接受，隻聽從兩三個奸惡諂媚小人的話，陛下能夠隻和他們共同治理祖宗傳下的天下嗎？況且陛下認為織造是曆朝舊有的慣例，但不知道洪武以來不曾有，而是從成化、弘治時期才開始搜刮百姓的。憲宗、孝宗愛護百姓，節省財用的善政不隻一件，陛下卻不效法，唯獨仿效不好的地方，這是為什麼呢？陛下即位的詔書中，把太監得到寵幸的途徑幾乎全部廢除阻塞了，天下正在傳頌陛下的聖明德行，現在忽然發生這件事，怎麼能取得天下人的信任呢？”
世宗聽後，雖然表麵上說自己考慮不周，但最終仍是按照自己的想法去做了。這樣，“大禮儀”事件令楊廷和與皇帝之間的矛盾初見端倪，後來他屢犯龍顏，二人矛盾日趨尖銳。楊廷和自己也很清楚，長此以往，說不定哪日就會大禍臨頭。於是，他屢次上疏請求告老還鄉。世宗先是假意挽留了幾次，嘉靖三年（1524）正月，便聽憑楊廷和退休離去。隨後，世宗又假惺惺地給賜璽書，按照以往慣例給予楊廷和車馬俸祿並護送其回鄉，重又給予其一子錦衣衛指揮使的職務。
楊廷和離朝以後，世宗終於讓內閣議定稱孝宗為皇伯父而稱自己的生父為皇父。楊廷和的兒子修撰楊慎率領群臣在皇宮門外伏地哭泣力爭，被廷杖且貶職到雲南。不久王邦奇彈劾楊廷和及其次子兵部主事楊瓊、女婿修撰金承勳、同鄉侍讀葉桂章。他們都被關入錦衣衛監獄，後經審訊，未找到犯罪事實，方才被釋放。
嘉靖七年（1528），《明倫大典》纂修完成，世宗下詔給阻止大禮的大臣定罪，說楊廷和錯誤地主張《濮議》，詐稱自己是皇帝老師、策劃決定皇帝即位的國家元老，依律當斬首。念其擁立之功，加恩將其削官為民。
次年六月，楊廷和在淒涼中辭世，享年71歲。直到隆慶元年（1567），朝廷才恢複了楊廷和的官籍，追贈太保，諡號“文忠”。
楊廷和作為四朝重臣、兩朝首輔，其功績可謂突出。在武宗昏庸、宦官擅權、奸佞橫行的正德朝，他能夠衝破重重困境，“鎮靜持重”、“補苴匡救”，兢兢業業，支撐危局；又在嘉靖朝力排眾議，據理力爭，直觸龍顏，維係封建禮製，正、嘉兩朝，他除弊推新，銳意改革，雖然改革因他的被迫離職而未能深入，但還是對後世產生了深遠的影響，為以後的改革開啟了先河。