巴甫洛夫極不情願對此事進行研究，但最後還是決定了解一下，因為在他來看，這完全是一種生理學現象――看見喂養者或聽到喂養者的聲音的刺激，在狗的大腦裏產生一種反射，該反射引起了“精神性分泌”。1902年，他開始研究這種與腺體反應沒有固定聯係的刺激在什麼時候以什麼方式引起這種反應。終其一生，他一直在對此進行研究。
巴甫洛夫雖是外科專家，卻並沒有為這項研究創造過一隻胃囊。由於狗一看到喂食者即產生胃液與唾液，他隻需在唾液腺體上做一隻簡單的小囊，並將其掛在高處，導入一個收集和記錄的裝置就可以了。狗在接受訓練後可以站在桌子上一動不動，因為這樣可以得到獎賞、撫弄和喂食。為了逗人高興，它往往不等人命令就自己跳到桌子上，極有耐心地站在上麵，脖子上鬆鬆地掛著套圈，連接在一些檢測裝置上。套圈很有必要，因為它可用來保證檢測裝置、連接小囊與收容器和記錄筒的橡皮管不受損壞。狗麵對一扇帶窗的牆，前麵有一隻喂食桶，食物可通過機械裝置倒進該桶。
食物一到狗的口裏，其唾液即自動溢出。由於這是一種不需要訓練的反射，巴甫洛夫將食物叫做“非條件刺激”，將這種唾液反應叫做“非條件反射”。然而，他所要研究的是中性的刺激與同樣的反射之間的聯係。最典型的模式是，為了不對狗形成信號作用，實驗者在狗看不到的地方發出響聲。響聲可通過搖鈴或按蜂鳴器產生，且能引起食物倒向喂食桶，傾倒的時間差為五到三十秒。起初，鈴聲或蜂鳴器聲隻會引起一般反射――狗豎起耳朵――但不出現唾液反射。但在幾輪試驗之後，僅這種聲音就可使狗的唾液自動溢出。按巴甫洛夫的說法，聲音已變成引起唾液反應的“條件刺激”，唾液反應則已成為聲音的“條件反射”。
巴甫洛夫及其助手們變換出各種形式繼續這個實驗。他們常不用聲音，而使用閃爍的燈光，或在窗外轉動一個物體，或操縱某個可碰觸到狗的儀器，或拉動狗圈的某個部位，或變換中性刺激與喂食之間的時間差等。在所有情況下，中性刺激都可變成條件刺激，隻是其難易程度略有不同。中性氣體（非食物氣味）約需二十多次才能成為條件刺激，在狗的視力所及之處轉動物體僅需要五次，高聲的蜂鳴器僅隻一次就夠了。
心理學家可能將這種條件形成過程稱作聯想認知，但巴甫洛夫卻用生理學的術語對其進行了解釋。他向導師塞基洛夫和第一個提出反射學說的笛卡爾表示謝意，並指出，非條件反應，比如將食物放進嘴裏時出現的唾液反應，是大腦反應，是存在於脊柱或下腦中樞中的感覺和運動神經之間的直接連接。相比較而言，條件反射，比如聽到鈴聲或其他中性刺激的聲音時出現唾液現象，是條件過程在大腦皮層裏建立新的反射通道的結果。
巴甫洛夫以詳盡的細節闡述了他的大腦定位反射理論，以支持其就條件形成所獲得的發現。但在除俄國之外的其他地方，這個學說大多遭到人們的忽視，在美國甚至遭到心理學家卡爾?拉什利（Karl Lashley）的全盤否定。拉什利切除了老鼠不同部位和不同量的大腦皮質，再讓其學習迷宮走法，發現老鼠學習能力的缺失與任一具體的皮層區的損壞沒有關係，隻與切除掉的總量產生關係。
然而，巴甫洛夫的生理學理論絲毫沒有影響人們對其實驗數據和條件反射法則的熱烈歡迎程度，大家都認為這是對心理學研究的極大貢獻。
巴甫洛夫相信，他已經找到了動物和人類認知的基本單元。他說，所有學習得來的行為，不管是在學校裏還是在外麵獲得的，“隻不過是一長串的條件反射”，其獲得、保持和消失均受到他和他的助手們所發現的一些定律的控製。他的思想深刻地影響了俄國20世紀初期至50年代的心理學，但在西方，許多年裏它一直鮮為人知，即使巴甫洛夫於1904年在諾貝爾獲獎致辭裏已經提及條件反射。