第三節卵母細胞漿內單精子注射
卵母細胞漿內單精子注射（ICSI）試管嬰兒，主要用於治療男性不育。近來由於環境汙染和精神壓力等因素的影響，男性少弱畸形精子症患者明顯增加。於是。人們嚐試通過顯微受精技術幫助少弱畸形精子穿過透明帶。卵細胞漿內單精子注射受精率高，而且能顯著降低多精受精率。目前無論是來自自然射精的精液，還是取自附睾、睾丸、逆行射精膀胱內的精子行卵細胞漿內單精子注射，甚至是精細胞卵漿內單精子注射，都獲得了成功，使許多無精症的患者也有了生育的可能。
適應證
1少弱精ICSI僅需數條精子即可達到受精、妊娠。ICSI是嚴重男性因素不育患者的最有效的治療方法，但目前尚無統一而明確的ICSI治療標準。由於各實驗室ICSI指征差異較大，以及患者精液常規參數的波動，實驗室工作中取消ICSI治療是常有的事。但普遍認為需要ICSI輔助授精治療見於：
（1）嚴重少精症患者，即一次射出的精液中精子密度≤2×106/ml。
（2）當精子總數＞2×106/ml，而＜20×106/ml時，其活動率＜40%,或Ⅱ106/ml，則按嚴格標準進行精子形態學檢查，形態正常精子＜4%，或精子活動率＜5%。
（4）手術獲得性附睾或睾丸少弱精子。
2臨界性少弱精子是否應采用ICSI尚有爭議。有觀點認為，由於引入ICSI治療的時間尚短，可能存在對後代的潛在影響，其危險性有待級以上運動精子＜25%,或畸形精子率＞85%。
（3）精子總數≥20×進一步觀察，對該項新技術的運用要持謹慎態度。對輕度男性因素不育患者，臨界少弱精經精液處理後，一般均可獲得足以進行傳統IVF的精子，不應采用ICSI治療。
3原因不明不育對原因不明不育患者，可能有目前尚無法檢測出的免疫因素或精子及卵子受精能力的缺陷。因此現有觀點認為，對於原因不明不育夫婦，如果卵子的數量允許，可行部分ICSI，部分傳統IVF，這樣可以最大限度地為患者提供可移植的胚胎。
4前次IVF不受精若前次傳統IVF受精率＜25%，則再次IVF時應行ICSI。
5圓頭（頂體缺乏）精子或完全不活動精子對於圓頭（頂體缺乏）精子或完全不活動精子，ICSI是唯一的方法。不活動精子可通過低滲試驗選擇活精子或直接應用其睾丸精子進行ICSI，有助於提高受精率。由於目前對於圓頭精子進入卵細胞後的受精進程缺乏了解，圓頭精子行ICSI的安全性尚無保證，故應慎重。
6無精症通過手術自附睾或睾丸可獲得數目很少或活動力很差的精子，傳統IVF需要的精子數量較多，因此必須使用ICSI。阻塞性無精症患者睾丸的精子生成功能尚屬正常，但輸精管阻塞，精子不能射出。此類患者可行附睾手術取得精子。多數中心現已改進成經皮附睾穿刺抽吸取精術（PESA）。當附睾缺如或完全機化時，從睾丸取出的精曲小管中分離精子（TESE）進行ICSI亦可治療阻塞性無精子症的不育。非阻塞性無精症是由於睾丸精子生成障礙所致，可采用睾丸精曲小管精子或精細胞ICSI治療由於嚴重生精功能低下的非阻塞性不育患者。但生精障礙往往由於遺傳性疾病，如Y染色體微缺失等導致，故應慎重，並向患者交代遺傳之可能性。PESA、TESE是有創性的，一旦有多餘附睾或睾丸精子應予以冷凍保存。由於睾丸精子數量少、活動力更差、更難以耐受冷凍保存，即使凍融後亦難以找到活精子進行ICSI。Cohen等建議將如此少量的睾丸精子貯存於卵母細胞透明帶殼內凍存。
7精液凍存欲行IVF夫婦之男方取精困難者，為預防取卵後不能射精，平時可收集精液凍存備用。由於精子經冷凍後活動能力下降，受精能力亦可能下降，可采用ICSI行個體授精。
8體外成熟卵子不成熟卵子經體外培養成熟（IVM）後，由於體外培養時間較長，透明帶變硬，精子不易穿透，為保障受精，建議行ICSI輔助授精。成熟卵子經冷凍保存後，亦可由於體外培養時間過長而致透明帶變硬，亦建議使用ICSI授精。
準備工作
1注射針和固定針目前商品化的注射針規格統一，清潔無菌，獨立包裝省去了自製的麻煩，現在許多中心都購買注射針進行ICSI。
2針的製備如果需要自製注射針和固定針，需要特定的儀器設備。
3精子的準備
（1）少弱精精液可用密度梯度離心法處理，嚴重少弱精者可將液化後的精液采用Mini密度梯度離心法進行處理。
（2）行附睾穿刺抽吸取精時，應在注射針筒中預先吸入1ml培養液，抽吸附睾液後，連同1ml培養液注入培養皿中，這樣防止少量的附睾液黏在穿刺針筒中損失掉，另一方麵也便於觀察抽吸液中精子的濃度。但這樣又稀釋了抽吸液，因此常需離心（1000r/min×10分鍾）後使用，若其中活動精子計數較高，如＞10/HP也可直接使用。
（3）用睾丸精子ICSI時，先將精曲小管用兩張玻片或兩支針撕碎，再將此混懸液吸入離心管中，靜置培養箱孵育一段時間，直到用前反複吹打混勻，再靜置數分鍾，待大塊組織沉澱後，將上層液體離心（1000r/min×10分鍾）後使用。
4ICSI操作皿的準備一般來說，一個ICSI操作皿裏應有培養液液滴、聚乙烯吡咯酮烷（PVP）液滴、精子液滴和精子與培養液或PVP混合液滴這幾種。
5卵母細胞的處理超促排卵、取卵等步驟同傳統體外授精。取卵後在受精用培養基內經2小時的預培養，此時可將冷凍保存的透明質酸酶取出，置37℃恒溫箱內複溫。在進行ICSI前，將包繞著顆粒細胞的卵母細胞置於透明質酸酶中，連續吹打數次，將大部分顆粒細胞去除。為防止過度消化，作用時間應少於1分鍾。然後將卵子吸出，置於培養液中，換用不同內徑的巴斯德毛細玻璃管繼續吹打，直到完全去除顆粒細胞。再將卵子用培養液衝洗數次，培養至進行顯微注射。
6顯微注射係統的建立
（1）不同的顯微係統連接管內充填的介質不同，有的使用空氣介導，有的用礦物油或fluorinet。如果是液體介質，進行顯微注射前，將顯微操作儀的注射器及連接塑料膠管內充滿該介質，避免管內殘留氣泡。
（2）顯微操作儀的塑料膠管的一端連接有金屬持針器，左側的顯微操作儀塑料膠管的金屬持針器上安置顯微固定針，右側的顯微操作儀塑料膠管的金屬持針器上安置顯微針，兩支注射器分別固定在微量控製泵上，以控製注射量。將各針連接到持針器上，如為液體傳導，將針內也充滿液體，注意不要產生氣泡。
（3）在低倍鏡下，調整固定針與注射針兩兩相對成一直線，注意要與顯微鏡平台保持至少培養皿塑料底層厚度的距離，這在Eppendorf等有位置記憶功能的操作係統中尤為重要。對於RI等氣動顯微注射係統來說，需要多製作一個培養皿，用以平衡針內外壓力。將準備好的ICSI皿（falcon1006）放入倒置顯微鏡載物台中即可進行顯微操作。
操作步驟
（1）將注射針降低放入幹淨的培養液或PVP液滴中，旋轉控製注射器的微調，調試注射針液體的進出速度。吸入少量培養液或PVP，將油液界麵保持在視野內以便觀察。靜置片刻，等待液麵平靜。
（2）精子製動時要注意注射針的角度，要使針尖碰到培養皿底部。角度不合適時，在培養皿底部會有注射針折彎處針尖向上的情況，這樣無法製動精子。不用PVP的直接在精子培養液液滴中進行精子製動；使用PVP的將注射針放入含精子的PVP液滴中，挑選形態正常的活精子，吸入注射針內，移至幹淨的PVP液中，應用注射針擠壓其尾部中段猛烈製動。然後再將精子從尾部吸入注射針，抬高注射針。精子尾部破損後，易黏住注射針管，應盡快進行注射，或讓精子在注射針內不時地移動地方。
（3）用巴斯德毛細玻璃管將一個卵母細胞從卵子培養皿中轉移至ICSI培養皿中轉至ICSI培養皿中的一個培養液液滴中。用固定針將MⅡ期卵母細胞通過負壓輕輕固定，第一極體在12點或6點處，避免注射過程對卵母細胞紡錘體的損傷，將注射針移至含卵子的液滴。
（4）換至高倍鏡，調整固定針Z軸和顯微鏡焦距，直至卵細胞膜最為清晰。調整注射針Z軸，用針輕壓透明帶，將注射針尖調整到卵細胞正中。將精子移到注射針內口處，確認注射針、固定針內口及卵膜在同一水平後進針。穿過透明帶後繼續進針。同時，不斷調整平麵，可以看到卵膜隨注射針的頂入彈性伸展進入卵漿中。這時不要將精子注入，因為卵膜尚未破裂，精子其實是注在了卵膜外。穿刺卵膜近卵子中間時，可見卵漿回彈包住注射針，表明刺穿了卵膜。偶爾也見到盡管注射針已刺入接近9點處的卵膜，但仍未刺穿卵膜。這時可回抽針尖，在原穿刺口下方重新以較快速度進針。回吸少量卵漿，當卵漿開始快速吸入注射針時，表明卵膜已有破裂口，立即停止回吸。轉而注入吸出的卵漿及精子，再迅速出針。盡可能少地注入PVP液。注射完畢觀察卵膜回複正常位置，並觀察精子注入的部位是否隨卵膜的回複而至卵膜外、注入PVP的量以及是否有卵漿的外漏和卵子的損傷。