正文 第十一章 常見骨傷科動物模型的複製及研究方法實例(三)(2 / 3)

(2)去卵巢對大鼠性激素水平、子宮濕重及組織學的影響:OVX組大鼠的血清E2和P明顯下降;子宮明顯萎縮;子宮濕重顯著降低,表明卵巢切除完全。

(3)活體BMD:實驗前兩組大鼠活體全身及腰椎BMD無明顯差別;實驗結束時,OVX組與Sham組相比,活體腰椎(L3,L4,L5,L6及L3~6)BMD顯著下降(P<0.01),全身BMD差異無顯著性。

(4)離體BMD:OVX大鼠的離體L3,L4,L5,L6,L3~6BMD,股骨(除R3區)及脛骨近端R1區的離體BMD均明顯低於Sham組,其餘部位與Sham組比較差異無顯著性(P>0.05)。

(5)去卵巢對大鼠腰椎椎體結構的影響:掃描電鏡顯示腰椎骨小梁減少、變細,連接中斷,骨小梁表麵有吸收陷窩。

(6)去卵巢對大鼠骨生物力學性能的影響:腰椎壓縮強度和股骨力學性能均下降,前者更明顯,腰椎最大壓縮力下降率達33.32%。股骨三點彎曲試驗顯示OVX組大鼠剛性係數下降,其餘指標的差異均無顯著性。

例3骨組織形態學計量法是定量地評價骨的形成與吸收的有效方法。羅為民等將16隻雌性新西蘭兔隨機分為三組,A組為中藥治療組,B組為模型組,C組為正常對照組,采用該方法探討健脾補腎法對絕經後骨質疏鬆症的治療效果及其機製。

1.造模方法

7月齡雌性新西蘭兔分為A,B,C三組,A、B兩組兔子於戌巴比妥鈉靜脈麻醉下摘除雙側卵巢,C組單純剖腹後關閉。采用摘除雙側卵巢方法製成骨質疏鬆模型,6個月後取材。

2.觀察方法

取材前用四環素兩次標記。取髂骨骨塊,用0.5% Villanueva染色,切片機製成10μm厚不脫鈣切片,VIDAS全自動圖像分析係統進行骨計量,每個標本測10個視野測量下列指標:①單位體積骨小梁骨量BV/TV;②平均骨小梁寬度Tb.Th;③相當類骨質量OV/BV;④平均類骨寬度O.Th;⑤四環素標記間平均距離DDL;⑥骨形成麵OS/BS;⑦礦化沉積率MAR;⑧四環素雙標記麵DLS/BS;⑨四環素標記麵Tels/BS;⑩礦化延遲時間MLT;B11骨形成率BFR/BS。

3.研究結果

結果顯示去勢術後6個月可製成絕經後高轉換型骨質疏鬆模型。治療組骨量增加,骨形成率增高,四環素雙標記血及骨形成麵顯著增加,說明健脾補腎法能提高骨代謝轉換,增加骨量,延長成骨細胞成骨期,恢複骨骼的正常功能。

甲狀旁腺切除法

(一)複製機製

大鼠於切除甲狀旁腺後,因甲狀旁腺素的缺乏使體內1,25-(OH)2D3合成減少,腸道對食物中鈣、磷吸收減少,腎髒對鈣的重吸收作用減弱,以致動員體內鈣庫,骨吸收和分解加速,從而導致骨質疏鬆。

(二)複製方法

普通級雌性Wistar大鼠,麻醉後取仰臥位固定,縱形切開大鼠頸部正中皮膚、皮下組織。用眼科剪剪開頸闊肌,鈍性分離頸前筋膜,用拉鉤將肌群拉向外側,顯露甲狀軟骨,挑起氣管,用止血鉗夾住甲狀腺,甲狀旁腺呈針頭大小,米白色,位於甲狀腺內前外側,左右各1個。用小鑷子分別夾住兩側甲狀旁腺,用1號絲線結紮後切除。縫合頸闊肌、頸前肌及筋膜、皮下組織和皮膚。術後6天在麻醉下拆線,以顆粒飼料飼喂大鼠3個月。

(三)研究方法實例

例4洪誌勇等采用甲狀旁腺切除術法製作骨質疏鬆症動物模型,術後3個月,用GZY-B型骨皮質指數自動測量儀檢測大鼠右股骨X線片,手術組與假手術對照組的骨皮質指數分別為50.84%±2.20%和61.13%±2.09%,根據骨質疏鬆症診斷標準(骨皮質指數<55%),可認為骨質疏鬆症模型已初步建立。

1.造模方法

采用甲狀旁腺切除術法製作骨質疏鬆症動物模型。

2.觀察方法

骨皮質指數測定術前及術後3個月對甲狀旁腺切除組及假手術對照組大鼠的右後肢股骨拍攝X線片。X線片拍攝條件:電壓為30kV,電流為30mA,時間為0.4秒、球管至膠片距離為85cm。用自動化衝洗機衝洗膠片。采用GZY-B型骨皮質指數自動測量儀對股骨X線片進行掃描,並計算骨皮質指數(x±s)。

3.研究結果

術後3個月動物股骨骨皮質指數較術前平均減少,有顯著性差異

二、藥物類

維A酸法

(一)複製機製

維A酸引起骨質疏鬆發生的機製是由於維A酸激活破骨細胞,促進骨吸收,但不抑製成骨細胞的活性,使骨吸收超過骨形成,導致大鼠出現骨質疏鬆。在模型的特征上,除骨量顯著減少外,有明顯的骨小梁稀疏、骨皮質變薄和骨髓腔擴大。該模型具有操作簡便,時間短,成功率高的特點。

(二)複製方法

動物選用3月齡雌性SD大鼠,將維甲酸配製成混懸液,按85mg/kg?d維A酸量灌胃,每日1次,共15天。

(三)研究方法實例

例5熊詠民等為了研究镓鹽對骨質疏鬆大鼠骨代謝的影響,用維A酸建立大鼠骨質疏鬆模型。

1.造模方法

按上法造模,對照組用蒸餾水灌胃。

2.觀察方法

造模後每組隨機選5隻大鼠處死,取血、尿及骨觀察模型複製情況。

3.研究結果

(1)模型期血清檢測結果:實驗結果顯示,與正常組相比,骨質疏鬆組(表中簡稱骨鬆組,下同)鈣、磷有升高趨勢,BGP有降低趨勢,AKP、TRAP均較對照組顯著增高。

(2)尿檢測結果:骨質疏鬆組尿羥脯氨酸及尿羥酐較正常對照組有升高趨勢。

(3)骨組織改變:骨膠原及蛋白聚糖含量測定,骨質疏鬆組己糖醛酸含量顯著降低,氨基己糖及骨膠原含量亦有降低趨勢。骨質疏鬆組大鼠與正常對照組比較,總骨密度降低3.92%,股骨骨密度和腰椎骨密度降低8.33%,但無顯著性差異。骨形態計量學結果顯示:骨質疏鬆組平均骨小梁寬度、平均骨小梁間距、平均骨皮質厚度以及骨小梁百分比與對照組比較,均有顯著性差異。

例6張軍生等把20隻小鼠隨機分成對照組和維A酸灌胃組,2周後處死小鼠,利用骨組織計量學方法觀察維A酸對於小鼠脛骨的影響,結果顯示維甲酸灌胃組小鼠小梁骨體積明顯減少,小梁板厚度減少,且空間結構也發生改變。

1.造模方法

將維A酸膠囊中粉末共200mg取出,研碎,加蒸餾水160ml配製成1.25mg/ml的懸液。將20隻小鼠隨機分成2組,給藥組予上述藥物按每隻1ml/d灌胃,1次/天,共2周。對照組予同體積蒸餾水灌胃。

2.觀察方法

造模2周後,拉頸處死小鼠,分離脛骨,10%甲醛固定2天。15%乙二胺四乙酸脫鈣,經75%、80%、95%、100%二甲苯脫水透明,石蠟包埋。製成5μm厚脫鈣骨切片。在普通顯微鏡下用OptonContron半自動圖像分析儀測量其形態學參數。