國民黨反共活動的在不斷升級，抗日民族統一戰線也麵臨著能不能堅持、怎樣堅持的嚴重問題。此時，中共中央審時度勢，分析抗戰大局情勢，進一步完善了旨在鞏固和發展抗日民族統一戰線的一係列方針、政策。中共中央認為，國民黨限共與摩擦的政策不會改變，但還沒有同共產黨立即分裂的意圖。因此，在擊退其反共高潮之後，仍然應該堅持國共合作。1940年間，毛澤東先後寫了《目前抗日統一戰線中的策略問題》。《放手發展抗日力量，抵抗反共頑固派的進攻》、《論政策》等重要文件，係統地總結了抗戰以來黨在統一戰線工作、尤其是反摩擦鬥爭中積累的豐富經驗，全麵闡述了鞏固和發展抗日民族統一戰線的基本政策和策略方針。
毛澤東強調：“在整個抗日戰爭時期，無論在何種情況下，我黨的抗日民族統一戰線的政策是決不會變更的。”但是，由於國民黨采取了反共政策，因此，黨的統一戰線政策的根本指導原則必須是又聯合又鬥爭，以鬥爭求團結。兩者的辯證關係是，“鬥爭是團結的手段，團結是鬥爭的目的。以鬥爭求團結則團結存，以退讓求團結則團結亡”。
毛澤東在分析統一戰線內部各種勢力的政治態度之後，指出黨為鞏固和發展抗日民族統一戰線的基本政策必須是：發展進步勢力，爭取中間勢力，孤立頑固勢力。發展進步勢力，是因為這個勢力是抗日民族統一戰線的基礎和支柱；爭取中間勢力，他們往往可以影響進步勢力同頑固勢力的鬥爭；孤立頑固勢力，是為了限製和縮小他們實施反動政策的範圍和能量也是原因之一。即便在對頑固勢力的鬥爭中，也必須按照“以鬥爭求團結”的策略原則，把握“有理、有利、有節”的分寸和尺度。所謂“有理”，即嚴守鬥爭的防禦性，決不無故進攻人家，也決不放棄自衛權利；所謂“有利”，即在控製鬥爭的局部性基礎上，鬥則必勝；所謂“有節”，即堅持鬥爭的暫時性，決不可無止境地鬥下去，必須適可而止。
中共中央的上述方針、政策和策略原則，正確地把握了民族鬥爭和階級鬥爭的關係，體現了中國共產黨相忍為國，一切為了抗戰，一切為了維護抗日民族統一戰線的博大胸懷。
然而，正如中共中央所預料的那樣，國民黨是不會放棄其反共政策的。於1940年下半年，國民黨將反共重心轉向華中地區，第二次反共高潮被掀起。7月16日，國民黨方麵向中共提出所謂“中央提示案”，企圖壓縮八路軍、新四軍的編製，限製共產黨在敵後發展抗日力量。10月19日，又發出“皓電”，限令八路軍、新四軍於1個月內，全部開到黃河以北的冀察地區。與此同時，國民黨調整軍事部署，將包圍陝甘寧邊區的軍隊增加到40萬之眾；密令第3戰區部署圍殲皖南新四軍軍部及其所屬部隊；密令湯恩伯、李品仙等部配合魯蘇戰區韓德勤部，準備進攻華中的八路軍和新四軍。
中共中央麵對空前嚴重的局麵，為避免內戰，於11月9日複電國民黨當局，駁斥了“皓電”的種種誣蔑不實之詞，堅決不同意讓華中敵後戰場的八路軍、新四軍全部北移的無理要求；同時作出重大讓步，決定皖南新四軍部隊“遵令北移”。但是，國民黨方麵反而將中共中央的態度視為軟弱，竟步步進逼，並於1941年1月悍然發動“皖南事變”，對正在北移的新四軍軍部及直屬部隊實行重兵包圍攻擊。新四軍皖南部隊9000餘人血戰七晝夜，麵對敵眾我寡的形勢，除2000餘人突出重圍外，其餘大部壯烈犧牲。軍長葉挺被扣，副軍長項英遇害。隨即蔣介石宣布新四軍為“叛軍”，下令取消其番號，從而把第二次反共高潮推到了極點。
“皖南事變”後，激起國內外一片輿論，人們為之震驚，視此為國共分裂、內戰的開始。然而，中共中央出於維護國家民族利益的考慮，決定：仍以抗日大局為重，堅持又聯合又鬥爭，以鬥爭求團結的政策，在軍事上嚴守自衛，在政治上堅決反擊，團結國內外一切可以團結的力量，把鬥爭進行得有理。有利、有節。1月20日，中共中央發布重建新四軍的命令，號召新四軍全體指戰員繼續堅持大江南北的抗日陣地，堅持團結抗戰。同時，通過各種途徑向國內和國際社會揭露幾年來國民黨頑固派製造反共事件的真相，並再次闡明了中國共產黨堅持團結抗戰的嚴正立場。
對於中國共產黨處理“皖南事變”善後的正確立場和合理主張，國內外進步和中間勢力的表示同情和支持，形成了反對國民黨頑固派倒行逆施的強大潮流。鑒於政治上的被動和孤立，國民黨頑固派不得不收斂其反共行徑。3月，蔣介石公開保證不再對中共黨進行圍剿，對八路軍、新四軍的北移和編製問題，也采取了含糊其辭的態度。至此，第二次反共高潮終於被擊退，中國的抗日民族統一戰線渡過了抗戰以來最大的一次危機。
進入1943年以後，世界反法西斯戰爭勝利發展，為中國的抗戰勝利提供了有利的國際環境。這種形勢要求中國內部加強團結，實現民主改革，鞏固和擴大抗日力量，徹底打敗日本侵略者。然而，隨著勝利前景的明朗化，國民黨當局卻更加敵視共產黨及其領導下的抗日力量，因此，企圖再次掀起反共高潮。