漢明帝死後，北匈奴乘機反撲。在匈奴貴族的唆使和支持下，焉耆、龜茲等國攻殺了東漢政府在西域設置的都護。匈奴圍困戊巳校都尉兵，殺了校尉關寵；東師也發兵援助匈奴。此外，反叛的西域各國還聯合進攻疏勒等國。班超孤立無援，處境十分困難。東漢政府看到無力固守東師，就令班超撤退。南道各國怕班超撤退後匈奴卷土重來，進行報複，都苦苦挽留班超，疏勒、於闐兩國國王挽留班超最為懇切。在如此情況下，班超決心留住西域。班超克服了重重困難，壓服了疏勒一部分親匈奴勢力，擊平了姑墨，並團結於闐、疏勒等國，利用東漢前後兩批援兵，迫使匈奴在西域南道的屬國莎車投降，擊敗了龜茲援助莎車的軍隊，和烏孫建立起友好關係，重新穩定了南道的形勢。
永元二年（90），大月氏貴霜王朝發兵七萬，越過蔥嶺進攻疏勒，企圖建立對西域的統治。班超率領西域南道各國軍隊擊退了大月氏的進攻，聲威大震，遂乘勝經營西域北道（今天山以北新疆地區）。第二年，北道的龜茲、姑墨、溫宿等國都歸附了東漢，班超在龜茲它乾城設立西域都護府，親自坐鎮北道；並命西域長史徐幹屯駐疏勒，與北道遙相呼應。公元94年秋，班超發龜茲、鄯善等八國軍隊七萬多人，討伐曾攻殺前西域都護、一直心懷二意的焉耆、危須、尉犁，俘虜了這些國的王侯貴族。自此，西域各國都紛紛向漢王朝交納人質，歸附了漢王朝。西域地區和中原的經濟文化聯係更加密切，通往西亞各國的“絲綢之路”也隨即暢通。
永元九年（97），班超派甘英出使大秦（伊朗），甘英達到條支國海濱（今波斯灣），臨海東渡，為安息人所阻而還。這是中國使節遠至波斯灣的第一次。
班超在西域奮鬥了30年，他運用各種方法，幫助西域人擺脫匈奴貴族的束縛，使西域重新與內地聯為一體，為增進漢族和西域各族人民的友誼，加強中原和西域地區的政治、經濟和文化的交往，維護多民族國家的統一，立下了偉大的曆史功勳，他自幼立下的誌向終於實現了。
班超投筆從戎的愛國精神，“不入虎穴，焉得虎子”，機智勇敢、堅韌不拔的頑強意誌，一直為後人所傳誦。