進入20世紀40年代後，人們開始對微生物的變異產生了新的興趣，臨床中抗生素的使用很快導致出現了對這些藥劑有抗性的菌株的出現，即抗藥性菌株的出現，並隨之帶來了臨床治療問題。這是一類顯然具有臨床意義的細菌變異，全世界的醫學細菌學家都把他們的注意力轉向闡明這種變異的機理。而幾個重大發現正是在這個契機之下發生的。
1941年，美國的比德爾比德爾（G.W.Beadle）和泰特姆泰特姆（E.L.Tatum）用粗糙脈孢黴代替高等植物或昆蟲作為研究材料，用X射線誘變篩選獲得了大量的營養缺陷型突變菌株（營養缺陷型是指某菌株經突變後，喪失了合成某種營養素的功能，若在培養基上培養必須添加相應的營養素才能生長。），這些突變菌株均不能在基本培養基上生長，需要添加相應的生長因素才可以生長。於是，在大量分析比較的基礎上他們提出了“一個基因一個酶”的假說，這個假說為以後的研究所證實。比德爾和泰特姆的創造性發現為生化遺傳學的發展奠定了基礎，他們首先把遺傳基因的功能與酶或蛋白質聯係起來，微生物營養缺陷突變型的發現也為進一步深入研究基因結構、調控、重組以及生物的形態分化和發育等創造了條件。
1943年，意大利遺傳學家盧裏亞（S.E.Luria）和天體物理學家德爾布魯克（M.Delbruck）進行了著名的波動性試驗，其結果證明細菌對噬菌體產生的抗性是細菌的基因自發突變所致，與它們是否同噬菌體接觸無關。他們的研究結果隨後又被美國人萊德伯格萊德伯格（Lederberg）於1952年的影印培養法（一種通過蓋章的方式達到在一係列培養皿的相同位置上出現相同的遺傳型菌落的接種和培養方法。）進一步證實，細菌的基因突變發生在它們與噬菌體或藥物接觸之前，影印培養法僅作為一種篩選手段，將自發產生的抗性突變從大量的突變中篩選出來。1944年，紐約洛克菲勒研究所細菌學家奧斯瓦爾多·艾瑞（Oswald Avery），麥克勞德（C.M.Macleod）和麥卡蒂（M.Mc Carty）在深入研究細菌轉化過程中，發現遺傳物質的化學本質就是DNA。這是一個革命性的發現，因為在這之前，一直認為遺傳物質是蛋白質，而這個發現徹底否定了這一看法，將科學家的視線從蛋白質轉移到了DNA這一真正的遺傳物質上來。1946年，萊德伯格和泰特姆（E.L.Tatum）又發現了一種與轉化作用不同的細菌基因重組方式——接合作用（雌雄細菌在菌體表麵一部分結合，雄菌的遺傳物質向雌菌內傳遞的現象），以後又發現基因的連鎖現象，至20世紀50年代初，又發現F因子這種細菌質粒。