（1861—1897年）
這個時期是以1861年巴斯德建立了胚種學說為標誌開始的。本時期的代表人物主要是法國著名微生物學家巴斯德（1822—1895年）和德國醫生、細菌學家科赫（1843—1910年），他們被分別稱為微生物學和細菌學的奠基人。
巴斯德在幫助解決當地釀酒廠在釀酒生產中酒質變酸的問題時，指出了發酵是由於微生物的作用，並假設出每一種發酵都是由特定的微生物生長和代謝所引起的，這些研究促使他發明了一種不被其他任何微生物汙染的微生物培養方法。早期他使用繁瑣的液體稀釋法來獲得純培養，後來他利用科赫發明的在固體培養基上分離的方法。為了完成這些工作，巴斯德創立了著名的滅菌方法——巴氏消毒法，並建立完成了稀釋和次代培養的無菌技術。無遮火焰、烤箱和消毒鍋都是巴斯德實驗室最先使用的。他在研究蠶病（蠶微粒子病，1865年）、雞霍亂（1879年）、炭疽病（1881年）和狂犬病（1885年）的工作中，證實了傳染病由病原微生物所引起，並發現久置的雞霍亂和炭疽病病原菌能誘發人體免疫力，從而使人類對傳染病本質的認識提高到了一個新的水平。
在上述理論的指導下，巴斯德提出了一係列行之有效對付和利用微生物的方法：應用加熱滅菌（即巴氏消毒法）解決了酒的變質（“酒病”）問題；應用消毒滅菌法來防止“腐敗病”；應用檢出並淘汰病蛾的方法來防止蠶病；發明用接種減毒菌苗的辦法來預防雞霍亂和牛、羊的炭疽病；他晚年還在狂犬病疫苗的研究上作出了貢獻，應用狂犬疫苗來防治人類的狂犬病。他一生主要著作有《乳酸發酵》《酒精發酵》《蠶病學》等。此外巴斯德還通過著名的曲頸瓶試驗證明了生物隻能來源於生物，提出了生命起源的“胚種學說”，從而推翻了當時盛行的“自然發生學說”，為生物學的發展做出了突出的貢獻。
另一位偉大的科學家科赫在培養細菌學方麵的巨大貢獻是發明了用固體培養基的“細菌純培養法”和把混合培養物純化的技術，並發明了固體培養基劃線分離純種法。這種技術給培養細菌學帶來革命性變化，使19世紀最後20年中細菌學領域開出絢麗的花朵。
科赫於1881年發明了流動蒸汽滅菌法。他還采用染色法觀察細菌的形態，並運用這些方法分離出多種傳染病的病原菌。他在牛的脾髒中找到了引起炭疽病的細菌，並且把這種細菌移種到老鼠體內，使老鼠感染了炭疽病，最後又從老鼠體內得到了和牛身上相同的細菌。這是人類第一次用科學的方法證明了某種特定的微生物是某種特定疾病的病原。他在實驗室中，在與牛體溫相同的條件下用血清在動物體外成功地培養了細菌。