第一卷 細胞內功能區隔與蛋白質分選
§序
與原核細胞物不同的是真核細胞具有複雜的由內膜構成的功能區隔。細胞內膜係統指在結構，功能或發生上相關的細胞內膜形成的細胞結構，包括核被膜、內質網、高爾基體及其形成的溶酶體和分泌泡等，以及其它細胞器如線粒體，質體和過氧化物酶體等膜包圍的細胞器（膜性細胞器）。
內膜係統形成了一種胞內網絡結構，其功能主要在於兩個方麵：其一是擴大膜的總麵積，為酶提供附著的支架，如脂肪代謝、氧化磷酸化相關的酶都結合在細胞膜上。其二是將細胞內部區分為不同的功能區域，保證各種生化反應所需的獨特的環境。
§第一章 蛋白質分選的基本原理
從係統發生來看內膜係統起源於質膜的內陷和內共生（線粒體、葉綠體），從個體發生來看新細胞的內膜係統來源於原有內膜係統的分裂。當細胞進行分裂時，不僅要進行染色體和細胞核的複製，同時各種細胞器通過吸收新合成的成分長大，然後隨著細胞的分裂分配到子細胞中去。細胞不能從無到有產生所有膜性細胞器，新的膜性細胞器來源於已存在細胞器的分裂。如果徹底移除細胞內所有的過氧化物酶體，細胞根本不能重建新的過氧化物酶體，因為過氧化物酶體中具有選擇性地接受細胞質內合成的蛋白質的轉位因子（translocator）。細胞內合成的蛋白質、脂類等物質之所以能夠定向的轉運到特定的細胞器取決於兩個方麵：其一是蛋白質中包含特殊的信號序列（signal sequence or targeting sequence ），其二是細胞器上具特定的信號識別裝置（分選受體，sorting receptor），因此內膜係統的發生具有核外遺傳（epigenetic）的特性。
一、蛋白質分選信號
細胞類至少存在兩類蛋白質分選的信號（圖6-1）：
①信號序列（signal sequence）：存在於蛋白質一級結構上的線性序列，通常15-60個氨基酸殘基，有些信號序列在完成蛋白質的定向轉移後被信號肽酶（signal peptidase）切除.
②信號斑（signal patch）：存在於完成折疊的蛋白質中，構成信號斑的信號序列之間可以不相鄰，折疊在一起構成蛋白質分選的信號。
蛋白質分選信號的作用是引導蛋白質從胞質溶膠進入內質網、線粒體、葉綠體和過氧化物酶體，也可以引導蛋白質從細胞核進入細胞質或從Golgi體進入內質網。這種分選信號的氨基酸殘基有時呈線性排列，有時折疊成信號斑，如引導蛋白質定向運輸到溶酶體的信號斑，是溶酶體酸性水解酶被高爾基體選擇性加工的標識。
圖6-1 兩類分選信號
每一種信號序列決定特殊的蛋白質轉運方向，如輸入內質網的蛋白質通常N端具有一段信號序列，含有6-15個帶正電荷的非極性氨基酸。由高爾基體返回內質網的蛋白質，其C端的四個氨基序列，一些已知的分選信號見表1。目前對於信號斑了解較少，主要是因為它存在於複雜的三維結構中，很難將其分離出來研究。
二、蛋白質分選運輸的途徑
蛋白質的分選運輸途徑主要有三類：
1、門控運輸（gated transport）：如核孔可以選擇性的主動運輸大分子物質和RNP複合體，並且允許小分子物質自由進出細胞核。
2、跨膜運輸（transmembrane transport）：蛋白質通過跨膜通道進入目的地。如細胞質中合成的蛋白質在信號序列的引導下，通過線粒體上的轉位因子，以解折疊的線性分子進入線粒體。
3、膜泡運輸（vesicular transport）：蛋白質被選擇性地包裝成運輸小泡，定向轉運到靶細胞器。如內質網向高爾基體的物質運輸、高爾基體分泌形成溶酶體、細胞攝入某些營養物質或激素，都屬於這種運輸方式。
這幾種運輸機製都涉及信號序列的引導和靶細胞器上受體蛋白的識別。
§第二章 膜泡運輸
細胞內部內膜係統各個部分之間的物質傳遞常常通過膜泡運輸方式進行。如從內質網到高爾基體；高爾基體到溶酶體；細胞分泌物的外排，都要通過過渡性小泡進行轉運。膜泡運輸是一種高度有組織的定向運輸，各類運輸泡之所能夠被準確地運到靶細胞器，主要是因為細胞器的胞質麵具有特殊的膜標誌蛋白。許多膜標誌蛋白存在於不止一種細胞器，可見不同的膜標誌蛋白組合，決定膜的表麵識別特征。
大多數運輸小泡是在膜的特定區域以出芽的方式產生的。其表麵具有一個籠子狀的由蛋白質構成的衣被（coat）。這種衣被在運輸小泡與靶細胞器的膜融合之前解體。衣被具有兩個主要作用：①選擇性的將特定蛋白聚集在一起，形成運輸小泡；②如同模具一樣決定運輸小泡的外部特征，相同性質的運輸小泡之所以具有相同的形狀和體積，與衣被蛋白的組成有關。
胞內膜泡運輸沿微管或微絲運行，動力來自馬達蛋白（motor proteins）。與膜泡運輸有關的馬達蛋白有3類：一類是動力蛋白（dynein），可向微管負端移動；另一類為驅動蛋白（kinesin），可牽引物質向微管的正端移動；第三類是肌球蛋白（myosin）,可向微絲的正極運動。在馬達蛋白的作用下，可將膜泡轉運到特定的區域，
一、衣被類型
已知三類具有代表性的衣被蛋白，即：籠形蛋白（clathrin）、COPI和COPII，個介導不同的運輸途徑（表2）。
表2 衣被小泡的類型與功能
衣被類型
GTP酶
組成與銜接蛋白
運輸方向
clathrin
Arf
Clathrin重鏈與輕鏈，AP2
質膜→內體
Clathrin重鏈與輕鏈，AP1
高爾基體→內體
Clathrin重鏈與輕鏈，AP3
高爾基體→溶酶體
高爾基體→植物液泡
COP I
Arf
COPαββ'γδεζ
高爾基體→內質網
COP II
Sar 1
Sec23/Sec24複合體，Sec 13/31複合體， Sec 16，Sec 12
內質網→高爾基體
（一）籠形蛋白衣被小泡
籠形蛋白衣被小泡是最早發現的衣被小泡，介導高爾基體到內體、溶酶體、植物液泡的運輸，以及質膜到內膜區隔的膜泡運輸。
籠形蛋白分子由3個重鏈和3個輕鏈組成（圖6-2），形成一個具有3個曲臂的形狀（triskelion）。許多籠形蛋白的曲臂部分交織在一起，形成一個具有5邊形網孔的籠子（圖6-3）。
圖6-2 籠形蛋白的結構，A電鏡照片，B分子模型，C衣被模型
圖6-3 籠形蛋白衣被小泡的形態
籠形蛋白形成的衣被中還有銜接蛋白（adaptin）。它介於籠形蛋白與配體受體複合物之間，起連接作用（圖6-4）。目前至少發現4種不同類型的銜接蛋白，可分別結合不同類型的受體，形成不同性質的轉運小泡，如AP1參與高爾基體→內體的運輸、AP2參與質膜→內體的運輸、AP3參與高爾基體→溶酶體的運輸。
圖6-4 籠形衣被小泡的組成
當籠形蛋白衣被小泡形成時，可溶性蛋白動力素（dynamin）聚集成一圈圍繞在芽的頸部（圖6-5），將小泡柄部的膜盡可能地拉近（小於1.5nm），從而導致膜融合，掐斷（pinch off）衣被小泡。動力素是一種GTP酶，調節小泡以出芽形式脫離膜的速率。動力素可以召集其它可溶性蛋白在小泡的頸部聚集，通過改變膜的形狀和膜脂的組成，促使小跑頸部的膜融合，形成衣被小泡。
圖6-5 Clathrin衣被小泡的掐斷過程
當衣被小泡從膜上釋放後，衣被很快就解體，屬於hsp70家族的一種分子伴侶（molecular chaperone）充當衣被解體的ATP酶，一種輔蛋白（auxillin）可以激活這種ATP酶。
（二）COP I衣被小泡
負責回收、轉運內質網逃逸蛋白（escaped proteins）返回內質網（圖6-6、7）。起初發現於高爾基體碎片，在含有ATP的溶液中溫育時，能形成非籠形蛋白包被的小泡。進一步的研究發現這種衣被蛋白複合體包含多達7種肽鏈。
內質網向高爾基體輸送運輸小泡時，一部分自身的蛋白質也不可避免的被運送到了高爾基體，如不進行回收則內質網因為磷脂和某些蛋白質的匱乏而停止工作。內質網通過兩種機製維持蛋白質的平衡 ：一是轉運泡將應被保留的駐留蛋白排斥在外，例如有些駐留蛋白參與形成大的複合物，因而不能被包裝在出芽形成的轉運泡中，結果被保留下來；二是通過對逃逸蛋白的回收機製，使之返回它們正常駐留的部位。
內質網的正常駐留蛋白，不管在腔中還是在膜上，它們在C端含有一段回收信號序列（retrieval signals），如果它們被意外地逃逸進入轉運泡從內質網運至高爾基體cis麵，則cis麵的膜結合受體蛋白將識別並結合逃逸蛋白的回收信號，形成COPI衣被小泡將它們返回內質網。內質網腔中的蛋白，如蛋白二硫鍵異構酶和協助折疊的分子伴侶，均具有典型的回收信號Lys-Asp-Glu-Leu（KDEL，圖6-8）。內質網的膜蛋白（如SRP受體）在C端有一個不同的回收信號，通常是Lys-Lys-X-X（KKXX，X：任意氨基酸），同樣可保證它們的回收。
COP I衣被小泡還可以介導高爾基體不同區域間的蛋白質運輸。
圖6-6 COP I衣被小泡的形態
圖6-7 COPI和COPII衣被小泡
圖6-8 KDEL序列
（三）COPⅡ衣被小泡
介導從內質網到高爾基體的物質運輸。最早發現於酵母ER在ATP存在的細胞質液中溫育時，ER膜上能形成類似於COP I的衣被小泡，某些溫度敏感型的酵母，由於COP II衣被蛋白發生變異，在特定溫度下會在內質網中積累蛋白質。
COP II衣被由多種蛋白質構成（參見表2），其中Sar1GTP酶與Sec23/Sec24複合體結合在一起，形成緊緊包圍著膜的一層衣被，Sec13/Sec31複合體形成覆蓋在外圍的一層衣被，Sec16推測可能是一種骨架蛋白，Sec12是Sar1的鳥苷酸交換因子。真核生物的COP II衣被蛋白亞單位具有一些橫向同源物（Paralog）[1]，這些同源物可能介導不同的蛋白質轉運，具有不同的調節機製。在實驗條件下，純化的Sar1、Sec23/Sec24、Sec13/Sec31等5種成分足以在人工脂質體上形成小泡，說明這些成分具有改變膜的形狀和掐斷運輸小泡的功能。
COP II衣被小泡形成與內質網的特殊部位，稱為內質網出口（exit sites），這些部位沒有核糖體，由交織在一起的管道和囊泡組成網絡結構。
由內質網到高爾基體的蛋白轉運中，大多數跨膜蛋白是直接結合在COP II衣被上，但是少數跨膜蛋白和多數可溶性蛋白通過受體與COP II衣被結合，這些受體在完成轉運後，通過COP I衣被小泡返回內質網。
COP II衣被所識別的分選信號位於跨膜蛋白胞質麵的結構域，形式多樣，有些包含雙酸性基序[DE]X[DE]（D為Asp，E為Glu，X為任何一種氨基酸），如Asp-X-Glu序列，其他一些具有短的疏水基序，如FF，YYM，FY，LL，IL等等（其中F為Phe，Y為Tyr，M為Met，L為Leu，I為Ile）。
二、衣被的形成
衣被是在一類叫作衣被召集GTP酶（coat-recruitment GTPase）作用下形成的。衣被召集GTP酶通常為單體GTP酶（monomeric GTPase），也叫G蛋白，起分子開關的作用，結合GDP的形式沒有活性，位於細胞質中，結合GTP而活化，轉位至膜上，能與衣被蛋白結合，促進核化和組裝。
G蛋白具有兩類重要的調節蛋白，即：鳥苷酸交換因子（guanine-nucleotide exchange factor, GEF）和GTP酶激活蛋白（GTPase activating protein, GAP）。GEF的作用是使G蛋白釋放GDP，結合GTP而激活。GAP的作用是激活G蛋白的酶活性，使GTP水解，G蛋白失活，G蛋白本身的GTP酶活性不高。除單體G蛋白以外，三聚體G蛋白也起分子開關的作用，控製衣被小泡的形成。
衣被召集GTP酶包括Arf蛋白和Sar 1蛋白（圖6-9），Arf參與高爾基體上籠形蛋白衣被與COP I衣被的形成，Sar 1參與內質網上COP II衣被的形成，兩者的作用方式大體相似。質膜上籠形蛋白衣被的形成也與GTP酶有關，但其成分尚不明確。
衣被召集GTP酶大量存在於細胞質中，但處於結合GDP的失活狀態。當內質網上要形成COPII衣被小泡時，Sar 1釋放GDP結合GTP而激活，激活的Sar 1暴露出一條脂肪酸的尾巴，插入內質網膜，然後開始召集衣被蛋白，以衣被蛋白為模型形成運輸小泡。活化的衣被召集GTP酶還可以激活磷脂酶D（phospholipase D），將一些磷脂水解，使形成衣被的蛋白質牢固地結合在膜上。
衣被召集GTP酶對衣被的形成其動態調節作用，當多數衣被召集GTP酶處於結合GTP的狀態時，它催化衣被的形成；反之當多數衣被召集GTP酶處於結合GDP的狀態時，它催化衣被的解體。因此衣被的形成過程是邊形成便解體的動態過程，隻有在組裝速率大於解體速率時，才能形成衣被小泡。
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圖6-9 COP II衣被小泡的組裝
三、膜泡運輸的定向機製
衣被小泡沿著細胞內的微管被運輸到靶細胞器，馬達蛋白水解ATP提供運輸的動力。各類運輸小泡之所以能夠被準確地和靶膜融合，是因為運輸小泡表麵的標誌蛋白能被靶膜上的受體識別，其中涉及識別過程的兩類關鍵性的蛋白質是SNAREs（soluble NSF attachment protein receptor）和Rabs（targeting GTPase）。其中SNARE介導運輸小泡特異性停泊和融合，Rab的作用是使運輸小泡靠近靶膜。
（一）SNAREs
SNAREs的作用是保證識別的特異性和介導運輸小泡與目標膜的融合，動物細胞中已發現20多種SNAREs，分別分布於特定的膜上，位於運輸小泡上的叫作v-SNAREs，位於靶膜上的叫作t-SNAREs（圖6-10）。v-SNAREs和 t-SNAREs都具有一個螺旋結構域，能相互纏繞形成跨SNAREs複合體（trans-SNAREs complexes，圖6-11），並通過這個結構將運輸小泡的膜與靶膜拉在一起，實現運輸小泡特異性停泊和融合。實驗證明包含了SNARE的脂質體和包含匹配SNARE的脂質體間可發生融合，盡管速度較慢。這說明除了SNARE之外，還有其他的蛋白參與運輸泡與目的膜的融合。