1964年12月，格瓦拉代表古巴出席聯合國第19次大會，之後相繼訪問了阿爾及利亞、剛果(金)等8個非洲國家和中華人民共和國。當1965年3月14日回到古巴後，他與卡斯特羅在諸如對蘇關係、援助第三世界革命等問題上的分歧日趨嚴重。不久他辭去了自己的職務，4月1日他乘飛機離開了古巴，前往剛果。
卡斯特羅與切·格瓦拉在古巴擔任高官期間，格瓦拉抵製官僚主義，生活節儉，並且拒絕給自己增加薪水。他從沒上過夜總會，沒有看過電影，也沒去過海灘。一次在蘇聯一位官員家裏做客時，當那位官員拿出極昂貴的瓷器餐具來招待格瓦拉時，格瓦拉對主人說：“真是諷刺，我這個土包子怎麼配使用這麼高級的餐具？”同時格瓦拉周末還積極參加義務勞動，比如在甘蔗地或工廠裏勞動。
格瓦拉在給卡斯特羅的告別信中說：“哪裏有帝國主義，就在哪裏同它鬥爭；這一切足以鼓舞人心，治愈任何創傷。”而在他看來，非洲無疑是遭受帝國主義壓迫最嚴重的地區。切·格瓦拉先在剛果東部金沙薩領導遊擊戰爭，1966年返回拉丁美洲，深入玻利維亞叢林開展“遊擊中心”的革命活動。1967年10月7日，格瓦拉的遊擊隊伍被玻利維亞政府軍包圍，格瓦拉被俘。1967年10月9日，他被玻利維亞當局殺害，時年39歲。
格瓦拉是個滿懷激情的革命家，是一個為正義、為真理獻身的理想主義者。他寫信給子女：“你們應當永遠對於世界上任何地方、任何非正義的事情，都能產生最強烈的反感。這是一個革命者的最寶貴的品質。”身為阿根廷人，為了正義，他投身於古巴的革命事業；作為古巴國家的開創者，為了真理，他放棄了已有的一切，深入玻利維亞叢林，在極其艱苦的環境中繼續反帝的遊擊戰爭。他是一個“堂吉訶德”式的傳奇人物，總是不經意間給世人以驚奇，用自己的生命書寫著一個共產主義戰士的悲壯曆史。
作為個人，格瓦拉是堅強、剛毅的。在兩歲時，他患上了哮喘病。與疾病的長期鬥爭磨練了他超人的意誌和信心。在茂密的叢林，古巴聖克拉拉市的格瓦拉紀念碑方臉、白皙、劍眉、大胡子、頭戴圓形軟帽、右手握著衝鋒槍、嘴裏叼著雪茄的格瓦拉鎮定自若，有條不紊地指揮著遊擊戰爭，他被親切地稱為“紅色羅賓漢”。臨刑前，格瓦拉麵對敵人的槍口，毫不退縮，“開槍吧，膽小鬼！你要打死的是一個男子漢！”這是一個英雄的聲音，是一聲為了真理而不屈的怒吼！
格瓦拉犧牲以後，世界各國人們紀念他，出版了各種語言的傳記、影視作品，懷念他、讚揚他。在世人眼中，切·格瓦拉已經超越了革命者的身份，成為追求真理、正義的理想主義者的象征，成為拯救人類於苦難的精神偶像。
格瓦拉經典形象的由來
切·格瓦拉那幅頭戴貝雷帽、身穿拉鏈上衣的肖像，成為許多青年的珍藏。這幅照片被複製的數量，可以與《蒙娜麗莎》相媲美。照片上，格瓦拉堅毅而悠遠的眼神，成了一個永遠無法磨滅的瞬間。
這一經典瞬間的拍攝者，是古巴攝影大師阿爾伯托·迪亞斯·古鐵雷斯。
1960年3月5日，一艘比利時武器運輸船在哈瓦那碼頭意外爆炸，136名船員當場遇難。古巴《革命報》攝影記者古鐵雷斯，奉命前往報道船員們的葬禮場麵。就在古巴革命領袖卡斯特羅發表演講的時候，古巴傳奇英雄格瓦拉突然走向講台，眼疾手快的古鐵雷斯剛按下兩次快門，格瓦拉就轉身不見了。幾十年後，古鐵雷斯還清晰地記得當年拍照時的情景：