實例2：重組人鈣調磷酸酶B亞基的純度和肽圖譜分析
高錦等用RP-HPLC法對重組人鈣調磷酸酶B亞基（rhCNB）的純度和肽圖譜進行了測定，以比較不同批次產品的純度及其一級結構的一致性，對其進行質量控製。並用MALDI-TOF-MS法進行驗證。結果表明，運用梯度洗脫RP-HPLC法能對樣品進行純度檢查和肽圖譜分析，測得3批樣品純度均達到98%以上，肽圖譜能達到批間一致。同時用MALDI-TOF-MS法測定，純度結果二者相符，質譜肽圖經計算機輔助分析，確證rhCNB一級結構與天然鈣調磷酸酶B亞基（CNB）一致。證明該方法靈敏、準確、可靠。
（1）RP-HPLC法測定的rhCNB純度，樣品在保留時間tR= 43min處有一雜質峰，測得3批樣品主峰純度按峰麵積歸一化計算均大於98%，符合基因工程藥物純度的要求。
（2）MALDI-TOF-MS法測定rhCNB的純度及相對分子質量，圖譜中有分子離子峰[M+H]+，分子離子多電荷峰[M+2H]2+，[M+3H]3+，[M+4H]4+，多聚體離子峰[2M+3H]3+，[4M+3H]3+及雜蛋白（M*）峰，並可由分子離子峰的相對豐度看出樣品的純度，雖然不能定量，但可以看出樣品中含有少量的雜蛋白，與RP-HPLC測得有一雜蛋白峰相符，其可以作為純度分析的一個輔助手段。rhCNB相對分子質量測定值為19151（理論值為19157），測量誤差為0.03%。
（3）RP-HPLC法分析的rhCNB肽圖譜rhCNB含有169個氨基酸，胰蛋白酶可以特異性水解Lys和Arg殘基之後的肽鍵，CNB中含有6個Arg和15個Lys，酶切位點如下：
GNEASYPLEMCSHFDADEIK↓R↓LGK↓R↓FK↓K↓LDLDNSGSLSVEEFMSLPELQQNPLVQR↓VIDIFDTDGNGEVDFK↓EFIEGVSQFSVK↓GDK↓EQK↓LR↓FAFR↓IYDMDK↓DGYISNGELFQVLK↓MMVGNNLK↓DTQLQQIVDK↓TIINADK↓DGDGR↓ISFEEFCAVVGGLDIHK↓K↓MVVDV。
理論上應有21個裂解位點，產生18個肽段以及2種單氨基酸。但酶解常不完善或在非Arg、Lys殘基上切斷，因此產生肽段數不一定與理論值相符。本實驗將3批rhCNB樣品經胰蛋白酶酶解後的肽段用RP-HPLC法分析的各批間肽圖一致。
（4）MALDI-TOF-MS法分析的rhCNB肽圖譜對rhCNB經胰蛋白酶酶切後樣品進行MALDI-TOF-MS測定，在質譜肽圖上可以直接得出肽段的相對分子質量，較HPLC肽圖譜更直觀，如圖9-56所示。僅測相對分子質量為800～3100部分，共測得17個肽段，經計算機數據庫輔助分析，其中有13個肽段的相對分子質量與理論值相符，匹配度達76.5%，匹配情況見表9-9。胰蛋白酶專一裂解Arg和Lys羧基端的肽鍵，為了與催化位點結合，需一堿性側鏈。不過，當堿性側鏈後接酸性堿基或被其包圍時，賴氨酰肽鍵常變得不易進行胰蛋白酶水解。而且，後接堿性殘基脯氨酸的肽鍵不適於胰蛋白酶水解。由此可見在Asp-Lys-Asp序列中的賴氨酰殘基鍵最有可能抗胰酶消化，這個序列在rhCNB中出現了2次，均未裂解完全，出現3、14號峰。由於酶解不完善所造成的還有10、11、12、15號峰。另外有2、5、7、16號4個分子離子峰未能與hCNB理論氨基酸序列匹配，相對分子質量分別為1217.72、1521.97、1653.00、2488.23，可能是由於胰蛋白酶中殘留的胰凝乳蛋白酶等產生的專屬位點裂解，導致非Arg、Lys殘基上切斷而造成的。從質譜肽圖分析，rhCNB的一級結構與hCNB理論氨基酸序列相符。