正文 第一節藥用植物抗性基因工程(3 / 3)

硫堇廣泛分布於單子葉植物和雙子葉植物,在植物體的根、種子及葉也得到了多種硫堇蛋白。近年來研究表明,硫堇能抑製許多病原細菌(包括革蘭陽性和陰性菌)和真菌的生長,其抗菌機製可能是造成病原菌的細胞內物質泄漏。

(十)植物防衛素

植物防衛素(plantdefensin)因與動物防禦素同源而得名,相對分子質量與硫堇相當,一般有45-54個氨基酸殘基,合8個Cys,正因如此,人們曾將分離到的第1個防衛素叫作γ-thionin,直到與硫堇蛋白完全不同的高級結構的闡明才將它們區別開來。典型的植物防衛素包含一條三鏈的反平行的β-折疊和一段α-螺旋。其中α螺旋中的CXXXC(C代表Cys,X代表任意氨基酸,下同)片段的半胱氨酸殘基都通過二硫鍵與C-末端的β-鏈中的CXC片段的半胱氨酸殘基相連,這種由牛胱氨酸殘基穩定的α螺旋結構也見於昆蟲防衛素中。一係列植物防衛素氨基酸序列的比較研究表明,8個Cys,13、34的GIy以及11位的芳香氨基酸和29位的GIu都是嚴格保守的。

植物防衛素能抑製多種真菌的生長,大量研究表明它能導致真菌顯著而持續的鈣離子流入和鉀離子滲出,培養基中離子濃度的增加會降低防衛素的抗真菌能力,但植物防衛素在體外抑製真菌的精確機製目前還不十分清楚。

植物防衛素廣泛分布於種子植物,在植物的各種器官(葉、塊莖、花、種子和某些夾果等)中都發現過防衛素。對Arabidopsis的研究表明,植物防衛素基因是嚴格的器官特異性表達。目前所知,至少有4種防衛素(即來源於pea、tobacco、arabidopsis、radish)是被真菌感染後誘導的,因此防衛素在植物的防禦反應中起著重要作用,可能是抵禦或殺滅外來微生物的重要成分。

(十一)其他抗性基因

1.重金屬抗性基因

一些重金屬(如Cu,Zn等)對是植物的生長發育所必需的,但當環境中重金屬數量超過某一臨界值時就會使植物體內的代謝過程發生紊亂,生長發育受到抑製,嚴重的可導致植物死亡。許多生物在長期的進化過程中產生了對重金屬的抗性,其中一種非常有效的生物解毒方式就是通過生物體內金屬結合蛋白以及植物絡合素(phytochelatins,PCs)來螯合進入體內的重金屬。

(1)金屬硫蛋白金屬硫蛋白(metallothionein,MT)是Margoshes和Vallee於1957年首次從馬腎中提取得到的一種低相對分子質量的金屬結合蛋白。MT富含半胱氨酸殘基,通過其巰基與金屬離子結合可形成無毒或低毒的絡合物,從而解除重金屬的毒害作用。Casterlin和Barnett最先從大豆根中分離出這類金屬硫蛋白,由於其性質與動物體內的MT極為相似,故稱為類金屬硫蛋白(metallothionein-like)。類金屬硫蛋白基因的表達受植物發育階段和激素水平的調節,與動物MT不同的是重金屬的脅迫不能對其轉錄水平進行調節。

(2)植物絡合素植物絡合素(phytochelatin,PC)最初由Grill於1985年從重金屬處理的Ophiorrhizamungos懸浮細胞中分離得到。大量的研究證明,PC廣泛存在於植物界,其結構通式是(r-Glu-cys)n-Gly(n=2~11),並且PC種類還與植物和誘導的重金屬種類有關。但PC不是基因的直接翻譯產物,而是以牛胱氦酸為底物由植物絡合素合酶(phytochelatinsynthase,PCS)催化形成的多分子小肽。

目前十多個與重金屬脅迫誘導相關的基因己從萊豆、玉米、大麥和擬南芥中分離克隆,利用基因工程技術已實現了其中的一些基因在煙草、玉米等植物中的導入從而獲得了具有對某些重金屬抗性的轉基因植株。趙亞華和茹炳根報道用攜帶小鼠金屬硫蛋白(mMT-I)cDNA的根癌農杆菌LBA4404(CaMV35S:mMT-IcDNA:nos)感染枸杞幼莖外植體,在選擇培養基(MS+2,4-D0.2mg/L+Kam100mg/L+Cb500mg/L+Cd2+50μmol/L)上篩選轉化的愈傷組織,並在分化培養基(MS+6-BA0.2mg/L+IAA0.2mg/L+Kam50mg/L+Cb300mg/L+Cd2+100μmol/L)上得到再生小芽,繼續轉入生根培養基(1/2MS+NAA0.2mg/L+Kam50mg/L+Cb300mg/L+Cd2+100μmol/L)獲得再生植株,從而獲得了對Cd2+具有一定的抗性的轉mMT-I基因的枸杞植株。

2.抗鹽耐旱基因

土壤鹽漬化使全球20%的耕地和近半數的灌溉土地都受到不同程度的鹽害威脅,隨著農作物種植麵積的不斷減少,藥用植物的栽培也必然受到土地資源限製,因此開展藥用植物的抗鹽耐旱基因工程研究將會提供一個新的解決途徑。滲透調節物質是植物在高鹽或幹旱的逆境脅迫下維持體內滲透平衡和減少體內水分損失而產生和積累的一類小分子化合物,主要有以下幾類:①氨基酸及其衍生物,脯氨酸、甜菜堿等;②多元醇,如甘露醇、山梨醇等;③糖類,如海藻糖等。有關這類滲透調節物質合成酶的基因已被分離和克隆用於植物的抗旱耐鹽基因工程。以下著重介紹一些在農業上應用比較成功的抗鹽耐旱基因。

(1)△ˊ-吡咯啉-5-羧酸合成酶基因△ˊ-吡咯啉-5-羧酸合成酶(△ˊ-pyrroline-5-Cboxylatesynthase,PSCS)控製脯氨酸合成的一個位點。脯氨酸(proline)不僅是生物大分子的保護劑或羥基的清除劑,還是植物從脅迫條件恢複正常過程中迅速、有效的氮源、碳源和還原劑,而PSCS基因是一個雙功能基因,編碼γ-穀氨酰激酶和穀氨酸-5-半醛脫氫酶兩種酶,能催化從穀氨酸合成脯氨酸的最初兩步。將該基因轉化到煙草中,使轉基因煙草中脯氨酸的合成量比對照提高了8~10倍。

(2)甜菜堿醛脫氫酶基因甜菜堿醛脫氫酶(betainealdehydedehydragenase,BADH)是催化甜菜堿合成兩步酶促反應中的第2步反應的酶。甜菜堿(betalne)在合成後幾乎沒有進一步代謝,因此被認為是最有希望的滲透保護劑之一。目前BADH基因已在草莓、煙草、水稻等多種植物中實現了轉化,其轉基因植株在耐鹽性方麵得到了不同程度的提高。

(3)1-磷酸甘露醇脫氫酶基因和6-磷酸山梨醇脫氫酶基因1-磷酸甘露醇脫氫酶(mannitol-1-phosphatedehydrogenase,mtlD)和6-磷酸山梨醇脫氫酶[sorbitol-6-phosphate2-dehydro-genase(glucitol-6-phosphatedehydrogenase),gutD]都是從大腸埃希菌(E.coli)中克隆的分別編碼甘露醇(mannitol)和山梨醇(sorbitol)這兩種多元醇合成的關鍵酶。多元醇因含多個羥基,親水性強,能有效地維持細胞的膨壓,從而起到抗鹽的作用。通過將mtld和gutd單價或雙價基因導入到煙草、水稻、玉米和八裏莊楊等植物中,獲得的轉基因植株其耐鹽性在不同程度上得到了提高,其中兩個基因共轉化的效果比單個基因轉化有進一步提高,如轉mtld/gutd雙價基因的煙草和水稻對氯化鈉的耐鹽性分別可達2.0%和0.5%。

(4)肌醇甲基轉移酶基因肌醇甲基轉移酶(inositol-methyltransferase,Imtl)基因是從生長於南非沙漠中的冰葉午時花(Mesembryanthemumcrystallium)中分離得到的,該基因在鹽堿或幹旱脅迫下誘導表達,以肌醇為底物生成芒柄醇(D-ononitol),因其含有多個羥基親水能力強,能減少生理性幹旱造成的損失而使植物得以耐鹽。目前轉imtl基因煙草植株可耐1.2~1.5%氯化鈉。

(5)海藻糖-6-磷酸合成酶基因海藻糖-6-磷酸合成酶(trehalose-6-phosphate-synthase,TPS)是從真核生物中分離得到的一種海藻糖合成酶。海藻糖(trehalose)在高等植物中一般都不能合成,其在真核生物中的合成分別由tpsl和tps2兩個基因來完成。已有多個報道將tps基因導入到煙草、馬鈴薯等植物中使其抗鹽耐旱性得到了提高。

3.耐寒抗凍基因

寒凍是危害嚴重的自然災害之一,在寒凍經常發生的地區容易對大麵積人工栽培的藥用植物構成威脅,往往造成巨大經濟損失,而藥用植物耐寒抗凍基因工程的研究將會提供一個比較好的解決途徑。有關植物的耐寒抗凍的機製研究已經取得了一些進展,部分耐寒抗凍基因已被克隆並已應用於作物的耐寒抗凍基因工程。

(1)甘油-3-磷脂酰基轉移酶基因甘油-3-磷脂酰基轉移酶(slycerol-3-phosphateacyl-transferase)(EC2.3.1.15)對於決定磷脂上的脂肪酸不飽和度起重要作用,而植物的抗寒性與生物膜磷脂上的脂肪酸不飽和度緊密相關。因此,可克隆耐寒物種的該酶的編碼基因轉入到藥用植物中來提高藥材耐寒抗凍能力。目前已從南瓜、擬南芥、菠菜、豌豆中克隆了甘油-3-磷脂酰基轉移酶基因,轉該基因的煙草抗寒性明顯增強。

(2)抗凍蛋白基因抗凍蛋白(antifreezeprotein,AFP)是從一些生活在兩極高緯度寒冷海域中的硬骨魚類(teleosts)中分離得到的一類特殊的血清蛋白。目前研究較多的是I型抗凍蛋白(AFPI),可以通過人工合成獲得編碼該蛋白的基因,將其轉入到煙草等植物中提高了植株的抗寒性,這將為植物的耐寒抗凍基因工程帶來新的前景。

另外,一些植物低溫誘導表達基因已從許多植物中分離鑒定出來,如從擬南芥中分離得到的低溫誘導基因rab18和lti140等。植物耐寒抗凍基因隻是一種誘發基因,隻有在特定條件(主要是低溫和短日照)的作用下,才能啟動耐寒抗凍基因的表達,從而發展為耐寒抗凍能力。這些基因雖然被克隆出來,但由於其表達調控的機製尚不清楚,因此開展相關的基因工程研究還有待於進一步的工作。

4.抗除草劑基因

通過化學方法如施用除草劑來控製雜草已成為現代化農業不可缺少的一部分,在藥用植物的大麵積栽培過程中同樣也會采取這一措施,而除草劑的使用在消除雜草的同時也會傷害種植的藥材。在農業上,一個解決的辦法就是提高作物的抗除草劑能力。目前抗除草劑基因工程主要采取兩種策略,一種修飾除草劑作用的靶蛋白使其對除草劑不敏感或過量表達,作物吸收除草劑後仍能進行正常代謝作用;另一種是引入酶或酶係統,在除草劑發生作用前將其降解或解毒。以下著重介紹一些在農業上應用比較成功的抗除草劑基因。

(1)抗草甘膦基因草甘膦(glyphosate)是一種非選擇性,廣譜高效、低毒有機磷除草劑。它特異性地抑製植物和微生物芳香族氨基酸(色氨酸、酪氨酸、苯丙氨酸)合成途徑中5-烯醇丙酮酸莽草酸-3-磷酸合成酶(5-enolpymvyl-shikimate-3-phosphatesynthase,EPSPS)的活性,導致芳香族氨基酸缺乏,莽草酸積累,最終導致細胞死亡。目前利用基因工程技術通過表達aroA基因(E.coli細胞中編碼EPSPS基因)過量產生EPSPS或導入EPSPS的突變基,如sm-1已獲得了抗草甘膦的煙草、矮牽牛、番茄、大豆、小麥等。

(2)抗草丁膦基草丁膦(phosphinothricin,PPT)是非選擇性的廣譜除草劑Basta的活性成分。草丁膦除草作用機製是抑製植物的氨基酸生物合成酶-穀胱甘肽合成酶(gluta-minesynthetase,GS),GS可以解除硝酸鹽還原、氨基酸降解及呼吸中釋放出的氨的毒性。雖然草丁膦抑製細菌、植物及哺乳動物的GS,但它不能進入哺乳動物的血液和腦組織,因此草丁膦對哺乳動物是安全的。草丁膦乙酰CoA轉移酶(phosphinothficinaeetylCoAtransferase,PAT)催化草丁膦的自由氨基乙酰化,從而使除草劑草丁膦失活。目前編碼PAT的bar基因已被克隆並成功轉入了煙草、番茄、馬鈴薯等多種植物中。

(3)抗綠磺隆基因磺酰脲類除草劑和咪唑酮類除草劑(如綠磺隆等),都是通過抑製支鏈氨基酸(纈氨酸、亮氨酸、異亮氨酸)合成中的一個關鍵酶乙酰乳酸合酶(aeetolaetatesynthase,ALS)來表現除草劑的作用。研究發現,如果編碼ALS的基因發生突變,其表達所產生的異構ALS的活性就不再受磺酰脲類除草劑的影響而表現出一定的抗性。目前已從煙草、擬南芥中獲得了ALS的突變基因,通過轉基因技術獲得了抗除草劑綠磺隆的作物。

(4)具降解或解毒除草劑功能的基因一些對除草劑具有降解或解毒功能的墓因也已被克隆。溴苯睛(bromoxynil)是除草劑Buctfil的活性成分,抑製光係統Ⅱ電子傳遞,它對於生長素2,4-D不能控製的雜草特別有效。bxn基因編碼的腈水解酶可把溴苯腈轉變為無活性產物3,5-二溴-4-羥基苯甲酸從而起到降解溴苯睛達到抗除草劑的目的。另外,gox基因編碼的草甘膦氧化還原酶,能把草甘膦降解成無毒成分。tfda基因編碼2,4-D單氧化酶,能將2,4-D降解為非光和毒性的2,4-二氯苯酚。

5.抗氧化脅迫基因

生物逆境如細菌、病毒和非生物逆境如輻射、除草劑和極端溫度及水分脅迫等引起植物的初始反應都會產生大量部分還原、高能、不穩定的中間產物,稱為活性氧類(AOS),如單線態氧(1O2)、超氧離子(O2?-)、羥自由基(?OH)、過氧化氫(H2O2)等。因此,利用分子生物學手段對植物的氧化代謝進行修飾,提高植物抗氧化脅迫的能力,進而抗生物和非生物逆境已成為近年來植物抗性研究的一個新的方向。研究表明抗氧化酶類是植物抵抗氧化脅迫的關鍵因素,因此高表達單個抗氧化酶類基因是提高植物抗氧化能力一個重要策略,其中最常用於轉化的是編碼超氧化物歧化酶(superoxidedismutase,SOD)和穀胱甘肽還原酶(glutathionereduetase,GR)的基因。SOD通過歧化反應使(O2?-)轉變為H2O2,後者又被H2O2清除酶類分解成H2O;GR通過維生素C-穀胱甘肽循環使植物細胞重要的兩種非酶抗氧化劑——維生素C、穀胱甘肽得以再生。

利用基因工程技術將抗氧化脅迫基因導入植物中表達可提高植物的抗逆能力,如Cu/ZnSOD在馬鈴薯(Solanumtuberosumcv.Xanth)中的適度表達使其對百草枯(一種除草劑)的耐性達100μmol/L;MnSOD在苜蓿(Medicagosativa)中的表達使其獲得了對冷害和另一種除草劑acifluorfen的抗性。GR在煙草(Nicotianatabacum)中適度表達後使其對百草枯的抗性達到5~10μmol/L。